თითქმის ყველა ბიოქიმიური რეაქცია ფერმენტულია. ფერმენტები(ბიოკატალიზატორები) არის ცილოვანი ბუნების ნივთიერებები, რომლებიც გააქტიურებულია ლითონის კათიონებით. ცნობილია დაახლოებით 2000 სხვადასხვა ფერმენტი და მათგან დაახლოებით 150 იზოლირებულია, რომელთაგან ზოგიერთი გამოიყენება როგორც წამალი. ტრიფსინი და ქიმოტრიფსინი გამოიყენება ბრონქიტისა და პნევმონიის სამკურნალოდ; პეპსინი - გასტრიტის სამკურნალოდ; პლაზმინი - ინფარქტის სამკურნალოდ; პანკრეატინი - პანკრეასის სამკურნალოდ. ფერმენტები განსხვავდება ჩვეულებრივი კატალიზატორებისგან (ა) უფრო მაღალი კატალიზური აქტივობით; (ბ) მაღალი სპეციფიკა, ე.ი. შერჩევითი მოქმედება.

ერთი სუბსტრატის ფერმენტული რეაქციის მექანიზმი შეიძლება წარმოდგენილი იყოს სქემით:

სადაც E არის ფერმენტი,

S - სუბსტრატი,

ES - ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი,

R არის რეაქციის პროდუქტი.

ფერმენტული რეაქციის პირველი ეტაპის მახასიათებელია მიქაელის მუდმივი (K M). K M არის წონასწორობის მუდმივის ორმხრივი:

მიქაელის მუდმივი (KM) ახასიათებს ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის (ES) სტაბილურობას. რაც უფრო მცირეა მიქაელის მუდმივი (KM), მით უფრო სტაბილურია კომპლექსი.

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე უდრის მისი სიჩქარის შემზღუდველი ნაბიჯის სიჩქარეს:

სადაც k 2 არის სიჩქარის მუდმივი, ე.წ რევოლუციების რაოდენობაან ფერმენტის მოლეკულური აქტივობა.

ფერმენტის მოლეკულური აქტივობა(k 2) უდრის სუბსტრატის მოლეკულების რაოდენობას, რომლებიც განიცდიან ტრანსფორმაციას ერთი ფერმენტის მოლეკულის გავლენის ქვეშ 1 წუთში 25 0 C ტემპერატურაზე. ეს მუდმივი იღებს მნიშვნელობებს დიაპაზონში: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

ურეაზასთვის, რომელიც აჩქარებს შარდოვანას ჰიდროლიზს, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; ადენოზინტრიფოსფატაზასთვის, რომელიც აჩქარებს ატფ-ის ჰიდროლიზს, k 2 = 6,24∙10 6 წთ‾ 1; კატალაზისთვის, რომელიც აჩქარებს H 2 O 2-ის დაშლას, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.

ამასთან, ფერმენტული რეაქციის კინეტიკური განტოლება იმ ფორმით, რომელშიც იგი მოცემულია ზემოთ, პრაქტიკულად შეუძლებელია გამოყენება ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის კონცენტრაციის ექსპერიმენტულად განსაზღვრის შეუძლებლობის გამო. გამოხატვა სხვა რაოდენობებით, ადვილად განსაზღვრული ექსპერიმენტულად, ვიღებთ ფერმენტული რეაქციების კინეტიკურ განტოლებას,დაურეკა მიქაელის-მენტენის განტოლება (1913):

,

სადაც ნამრავლი k 2 [E]tot არის მუდმივის მნიშვნელობა, რომელიც აღინიშნება (მაქსიმალური სიჩქარით).

შესაბამისად:

განვიხილოთ მიქაელის-მენტენის განტოლების განსაკუთრებული შემთხვევები.

1) სუბსტრატის დაბალ კონცენტრაციაზე, K M >> [S], შესაბამისად

რომელიც შეესაბამება პირველი რიგის რეაქციის კინეტიკურ განტოლებას.

2) სუბსტრატის მაღალ კონცენტრაციაზე K m<< [S], поэтому

რომელიც შეესაბამება ნულოვანი რიგის რეაქციის კინეტიკურ განტოლებას.

ამრიგად, სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაციის დროს ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე იზრდება სისტემაში სუბსტრატის შემცველობის მატებასთან ერთად, ხოლო სუბსტრატის მაღალი კონცენტრაციის დროს კინეტიკური მრუდი აღწევს პლატოზე (რეაქციის სიჩქარე არ არის დამოკიდებული სუბსტრატის კონცენტრაციაზე) ( სურ. 30).

სურათი 30. - ფერმენტული რეაქციის კინეტიკური მრუდი

თუ [S] = K M, მაშინ

რომელიც საშუალებას გაძლევთ გრაფიკულად განსაზღვროთ მიხეელისის მუდმივი K m (სურ. 31).

სურათი 31. - მიქაელის მუდმივის გრაფიკული განსაზღვრება

ფერმენტის აქტივობაზე გავლენას ახდენს: (ა) ტემპერატურა, (ბ) გარემოს მჟავიანობა, (გ) ინჰიბიტორების არსებობა. ტემპერატურის გავლენა ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე განხილულია თავში 9.3.

გარემოს მჟავიანობის გავლენა ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე ნაჩვენებია სურათზე 32. ფერმენტის მაქსიმალური აქტივობა შეესაბამება pH მნიშვნელობის ოპტიმალურ მნიშვნელობას (pH opt).

სურათი 32. - ხსნარების მჟავიანობის გავლენა ფერმენტების აქტივობაზე

ფერმენტების უმეტესობისთვის, pH-ის ოპტიმალური მნიშვნელობები ემთხვევა ფიზიოლოგიურ მნიშვნელობებს (7.3 - 7.4). თუმცა, არსებობს ფერმენტები, რომლებიც საჭიროებენ ძლიერ მჟავე (პეპსინს - 1,5-2,5) ან საკმაოდ ტუტე გარემოს (არგინაზა - 9,5 - 9,9) მათი ნორმალური ფუნქციონირებისთვის.

ფერმენტის ინჰიბიტორები- ეს არის ნივთიერებები, რომლებიც იკავებენ ფერმენტის მოლეკულების აქტიური ცენტრების ნაწილს, რის შედეგადაც მცირდება ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე. მძიმე ლითონის კათიონები, ორგანული მჟავები და სხვა ნაერთები მოქმედებენ როგორც ინჰიბიტორები.

ლექცია 11

ატომის სტრუქტურა

ტერმინი „ატომის“ ორი განმარტება არსებობს. ატომიარის ქიმიური ელემენტის უმცირესი ნაწილაკი, რომელიც ინარჩუნებს თავის ქიმიურ თვისებებს.

ატომიარის ელექტრულად ნეიტრალური მიკროსისტემა, რომელიც შედგება დადებითად დამუხტული ბირთვისა და უარყოფითად დამუხტული ელექტრონული გარსისგან.

ატომის დოქტრინამ განვითარების გრძელი გზა გაიარა. ატომისტიკის განვითარების ძირითადი ეტაპები მოიცავს:

1) ბუნებრივ-ფილოსოფიური ეტაპი - ექსპერიმენტით დაუდასტურებელი მატერიის ატომური სტრუქტურის კონცეფციის ფორმირების პერიოდი (ძვ. წ. V ს. - ახ. წ. XVI ს.);

2) ატომის, როგორც ქიმიური ელემენტის უმცირესი ნაწილაკის შესახებ ჰიპოთეზის ფორმირების ეტაპი (XVIII-XIX სს.);

3) ფიზიკური მოდელების შექმნის ეტაპი, რომელიც ასახავს ატომის სტრუქტურის სირთულეს და შესაძლებელს ხდის მისი თვისებების აღწერას (მე-20 საუკუნის დასაწყისი)

4) ატომისტიკის თანამედროვე საფეხურს კვანტურ მექანიკას უწოდებენ. Კვანტური მექანიკაარის ფიზიკის დარგი, რომელიც სწავლობს ელემენტარული ნაწილაკების მოძრაობას.

ᲒᲔᲒᲛᲐ

11.1. ბირთვის სტრუქტურა. იზოტოპები.

11.2. ატომის ელექტრონული გარსის კვანტურ-მექანიკური მოდელი.

11.3. ატომების ფიზიკური და ქიმიური მახასიათებლები.

ბირთვის სტრუქტურა. იზოტოპები

ატომის ბირთვი- ეს არის დადებითად დამუხტული ნაწილაკი, რომელიც შედგება პროტონების, ნეიტრონების და სხვა ელემენტარული ნაწილაკებისგან.

ზოგადად მიღებულია, რომ ბირთვის ძირითადი ელემენტარული ნაწილაკები პროტონები და ნეიტრონებია. პროტონი (p) -ეს არის ელემენტარული ნაწილაკი, რომლის ფარდობითი ატომური მასა არის 1 amu და რომლის ფარდობითი მუხტი არის + 1. ნეიტრონი (n) -ეს არის ელემენტარული ნაწილაკი, რომელსაც არ აქვს ელექტრული მუხტი, რომლის მასა პროტონის მასის ტოლია.

ბირთვი შეიცავს ატომის მასის 99,95%-ს. გაფართოების სპეციალური ბირთვული ძალები მოქმედებს ელემენტარულ ნაწილაკებს შორის, რაც მნიშვნელოვნად აღემატება ელექტროსტატიკური მოგერიების ძალებს.

ატომის ფუნდამენტური მახასიათებელია დააკისროსმისი ბირთვები, პროტონების რაოდენობის ტოლია და ქიმიური ელემენტების პერიოდულ სისტემაში ელემენტის სერიულ ნომერს ემთხვევა. იგივე ბირთვული მუხტის მქონე ატომების კრებულს (ტიპს) ეწოდება ქიმიური ელემენტი. ელემენტები 1-დან 92-მდე რიცხვებით გვხვდება ბუნებაში.

იზოტოპები- ეს არის ერთი და იგივე ქიმიური ელემენტის ატომები, რომლებიც შეიცავს ერთნაირი რაოდენობის პროტონებს და სხვადასხვა რაოდენობის ნეიტრონებს ბირთვში.

სადაც მასური რიცხვი (A) არის ბირთვის მასა, z არის ბირთვის მუხტი.

თითოეული ქიმიური ელემენტი არის იზოტოპების ნაზავი. როგორც წესი, იზოტოპების სახელწოდება ემთხვევა ქიმიური ელემენტის სახელს. თუმცა წყალბადის იზოტოპებისთვის სპეციალური სახელებია შემოღებული. ქიმიური ელემენტი წყალბადი წარმოდგენილია სამი იზოტოპით:

რიცხვი p რიცხვი n

პროტიუმი H 1 0

დეიტერიუმი D11

ტრიტიუმი T 1 2

ქიმიური ელემენტის იზოტოპები შეიძლება იყოს სტაბილური ან რადიოაქტიური. რადიოაქტიური იზოტოპები შეიცავს ბირთვებს, რომლებიც სპონტანურად იშლება ნაწილაკების და ენერგიის გამოთავისუფლებით. ბირთვის მდგრადობა განისაზღვრება მისი ნეიტრონების პროტონის თანაფარდობით.

ორგანიზმში მოხვედრისას რადიონუკლიდები არღვევენ უმნიშვნელოვანესი ბიოქიმიური პროცესების მიმდინარეობას, ამცირებენ იმუნიტეტს, ანადგურებენ ორგანიზმს დაავადებებისათვის. ორგანიზმი თავს იცავს რადიაციის გავლენისგან გარემოდან ელემენტების შერჩევითი შთანთქმით. სტაბილური იზოტოპები უპირატესობას ანიჭებენ რადიოაქტიურ იზოტოპებს. სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, სტაბილური იზოტოპები ბლოკავს რადიოაქტიური იზოტოპების დაგროვებას ცოცხალ ორგანიზმებში (ცხრილი 8).

ს.შენონის წიგნში „კვება ატომურ ხანაში“ მოცემულია შემდეგი მონაცემები. თუ I-131-ის ორგანიზმში მოხვედრიდან არაუგვიანეს 2 საათისა მიიღება იოდის სტაბილური იზოტოპის მაბლოკირებელი დოზა, რომელიც უდრის ~100 მგ-ს, მაშინ ფარისებრი ჯირკვალში რადიოიოდის შეწოვა 90%-ით შემცირდება.

მედიცინაში გამოიყენება რადიოიზოტოპები

გარკვეული დაავადებების დიაგნოსტიკისთვის,

კიბოს ყველა ფორმის სამკურნალოდ,

პათოფიზიოლოგიური კვლევებისთვის.

ცხრილი 8 - სტაბილური იზოტოპების ბლოკირების ეფექტი

ფერმენტული რეაქციების კინეტიკა. კინეტიკა სწავლობს რეაქციების სიჩქარეს, მექანიზმებს და ისეთი ფაქტორების გავლენას, როგორიცაა ფერმენტების და სუბსტრატების კონცენტრაცია, ტემპერატურა, გარემოს pH, ინჰიბიტორების ან აქტივატორების არსებობა.

სუბსტრატის მუდმივი კონცენტრაციისას რეაქციის სიჩქარე პირდაპირპროპორციულია ფერმენტის კონცენტრაციის. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულების გრაფიკს სუბსტრატის კონცენტრაციაზე აქვს ტოლფერდა ჰიპერბოლის ფორმა.

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება ფერმენტის (a) და სუბსტრატის (b) კონცენტრაციაზე.

აღწერილია ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება სუბსტრატის კონცენტრაციაზე მიქაელის-მენტენის განტოლება:

სადაც V არის ბიოქიმიური რეაქციის სტაციონარული სიჩქარე; Vmax - მაქსიმალური სიჩქარე; კმ - მიქაელის მუდმივი; [S] - სუბსტრატის კონცენტრაცია.

თუ სუბსტრატის კონცენტრაცია დაბალია, ე.ი. [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

მაშინ

ამრიგად, სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაციის დროს, რეაქციის სიჩქარე პირდაპირპროპორციულია სუბსტრატის კონცენტრაციისა და აღწერილია პირველი რიგის განტოლებით. ეს შეესაბამება მრუდის საწყის სწორ მონაკვეთს V = f[S] (სურათი b).

სუბსტრატის მაღალ კონცენტრაციებში [S] >> კმ, როდესაც კმ შეიძლება უგულებელყო, მიქაელის-მენტენის განტოლება იღებს ფორმას, ე.ი. V=Vmax.

ამრიგად, სუბსტრატის მაღალი კონცენტრაციის დროს, რეაქციის სიჩქარე ხდება მაქსიმალური და აღწერილია ნულოვანი რიგის განტოლებით. ეს შეესაბამება მრუდის V =f [S] მონაკვეთს, x ღერძის პარალელურად.

სუბსტრატის კონცენტრაციებში, რომლებიც რიცხობრივად შედარებულია მაიკლისის მუდმივთან, რეაქციის სიჩქარე თანდათან იზრდება. ეს საკმაოდ შეესაბამება იდეებს ფერმენტული რეაქციის მექანიზმის შესახებ:

სადაც S არის სუბსტრატი; E - ფერმენტი; ES - ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი; P - პროდუქტი; k1 არის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნის სიჩქარის მუდმივი; k2 არის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დაშლის სიჩქარის მუდმივი საწყისი რეაგენტების წარმოქმნით; k3 არის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დაშლის სიჩქარის მუდმივი პროდუქტის წარმოქმნით.

სუბსტრატის კონვერტაციის მაჩვენებელიპროდუქტის (P) წარმოქმნით პროპორციულია ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის კონცენტრაციისა. სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაციის დროს ხსნარი შეიცავს გარკვეულ რაოდენობას თავისუფალი ფერმენტის მოლეკულებს (E), რომლებიც არ არის დაკავშირებული კომპლექსში (ES). ამრიგად, სუბსტრატის კონცენტრაციის მატებასთან ერთად, კომპლექსების კონცენტრაცია იზრდება და, შესაბამისად, იზრდება პროდუქტის წარმოქმნის სიჩქარეც. სუბსტრატის მაღალი კონცენტრაციის დროს, ყველა ფერმენტის მოლეკულა უკავშირდება ES კომპლექსს (ფერმენტის გაჯერების ფენომენი), შესაბამისად, სუბსტრატის კონცენტრაციის შემდგომი ზრდა პრაქტიკულად არ ზრდის კომპლექსების კონცენტრაციას და პროდუქტის წარმოქმნის სიჩქარე მუდმივი რჩება.

ამრიგად, ფერმენტული რეაქციის მაქსიმალური სიჩქარის ფიზიკური მნიშვნელობა ნათელი ხდება. Vmax არის ფერმენტის რეაქცია, რომელიც მთლიანად არსებობს ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის სახით..

მიქაელის მუდმივი რიცხვით შეესაბამება სუბსტრატის ისეთ კონცენტრაციას, რომლის დროსაც სტაციონარული სიჩქარე უდრის მაქსიმუმის ნახევარს. ეს მუდმივი ახასიათებს ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივას:

მიქაელის მუდმივის ფიზიკური მნიშვნელობაიმით, რომ იგი ახასიათებს ფერმენტის აფინურობას სუბსტრატის მიმართ. კმ-ს აქვს მცირე მნიშვნელობები, როდესაც k1 > (k2 + k3), ე.ი. ES კომპლექსის ფორმირების პროცესი ჭარბობს ES-ის დისოციაციის პროცესებზე. ამიტომ, რაც უფრო დაბალია Km მნიშვნელობა, მით მეტია ფერმენტის მიდრეკილება სუბსტრატთან. პირიქით, თუ Km დიდია, მაშინ (k2 + k3) > k1 და ES დისოციაციის პროცესები ჭარბობს. ამ შემთხვევაში ფერმენტის მიდრეკილება სუბსტრატთან დაბალია.

ფერმენტის ინჰიბიტორები და აქტივატორები . ფერმენტის ინჰიბიტორებინივთიერებები, რომლებიც ამცირებენ ფერმენტების აქტივობას. ნებისმიერი დენატაციური აგენტი (მაგალითად, მძიმე ლითონის მარილები, მჟავები) არის ფერმენტის არასპეციფიკური ინჰიბიტორები.

შექცევადი ინჰიბიტორებიარის ნაერთები, რომლებიც ურთიერთქმედებენ არაკოვალენტურად ფერმენტთან. შეუქცევადი ინჰიბიტორები- ეს არის ნაერთები, რომლებიც კონკრეტულად აკავშირებენ აქტიური ცენტრის ფუნქციურ ჯგუფებს და ქმნიან კოვალენტურ კავშირებს ფერმენტთან.

შექცევადი ინჰიბიცია იყოფა კონკურენტულ და არაკონკურენტულ. კონკურენციის დათრგუნვავარაუდობს სტრუქტურულ მსგავსებას ინჰიბიტორსა და სუბსტრატს შორის. ინჰიბიტორი იკავებს ადგილს ფერმენტის აქტიურ ადგილას და ფერმენტის მოლეკულების მნიშვნელოვანი რაოდენობა იბლოკება. კონკურენტული დათრგუნვა შეიძლება მოიხსნას სუბსტრატის კონცენტრაციის გაზრდით. ამ შემთხვევაში, სუბსტრატი ანაცვლებს კონკურენტულ ინჰიბიტორს აქტიური ადგილიდან.

შექცევადი ინჰიბირება შეიძლება იყოს არაკონკურენტულისუბსტრატს რაც შეეხება. ამ შემთხვევაში ინჰიბიტორი არ ეჯიბრება ფერმენტთან მიმაგრების ადგილს. სუბსტრატი და ინჰიბიტორი აკავშირებს სხვადასხვა უბნებს, ამიტომ არსებობს IE კომპლექსის, ისევე როგორც სამჯერადი IES კომპლექსის წარმოქმნის შესაძლებლობა, რომელიც შეიძლება დაიშლება პროდუქტის გათავისუფლებით, მაგრამ უფრო ნელი სიჩქარით, ვიდრე ES კომპლექსი. .

ავტორი თქვენი მოქმედების ბუნებაინჰიბიტორები იყოფა:

• კონკრეტული,
• არასპეციფიკური.

სპეციფიკური ინჰიბიტორებიმათ აქვთ გავლენა ფერმენტზე, უერთდებიან კოვალენტურ კავშირს ფერმენტის აქტიურ ცენტრში და გამორბენ მას მოქმედების სფეროდან.

არასპეციფიკური ინჰიბირებაგულისხმობს დენატური აგენტების (მძიმე ლითონების მარილები, შარდოვანა და სხვ.) ფერმენტზე ზემოქმედებას. ამ შემთხვევაში ცილის მეოთხეული და მესამეული სტრუქტურის განადგურების შედეგად იკარგება ფერმენტის ბიოლოგიური აქტივობა.

ფერმენტების აქტივატორებიარის ნივთიერებები, რომლებიც ზრდის ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეს. ყველაზე ხშირად ლითონის იონები (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+ და სხვ.) მოქმედებენ როგორც აქტივატორები. განასხვავებენ ლითონებს, რომლებიც მეტალოფერმენტების ნაწილია, რომლებიც კოფაქტორებიდა მოქმედებს როგორც ფერმენტის აქტივატორები. კოფაქტორებს შეუძლიათ ძლიერად დაუკავშირდნენ ფერმენტის ცილოვან ნაწილს, მაგრამ რაც შეეხება აქტივატორებს, ისინი ადვილად გამოიყოფა აპოენზიმისგან. ასეთი ლითონები არიან კატალიზური აქტის სავალდებულო მონაწილეები, რომლებიც განსაზღვრავენ ფერმენტის აქტივობას. აქტივატორები გააძლიეროს კატალიზური ეფექტი, მაგრამ მათი არარსებობა ხელს არ უშლის ფერმენტული რეაქციის გაგრძელებას. როგორც წესი, ლითონის კოფაქტორი ურთიერთქმედებს სუბსტრატის უარყოფითად დამუხტულ ჯგუფებთან. ცვალებადი ვალენტობის მქონე ლითონი მონაწილეობს ელექტრონების გაცვლაში სუბსტრატსა და ფერმენტს შორის. გარდა ამისა, ისინი მონაწილეობენ ფერმენტის სტაბილური გარდამავალი კონფორმაციის ფორმირებაში, რაც ხელს უწყობს ES კომპლექსის უფრო სწრაფ ფორმირებას.

ფერმენტის აქტივობის რეგულირება . მეტაბოლიზმის რეგულირების ერთ-ერთი მთავარი მექანიზმია ფერმენტების აქტივობის რეგულირება. ერთი მაგალითია ალოსტერული რეგულირება, რეგულირება აქტივატორებითა და ინჰიბიტორებით. ხშირად ხდება, რომ მეტაბოლური გზის საბოლოო პროდუქტი მარეგულირებელი ფერმენტის ინჰიბიტორია. ამ ტიპის დათრგუნვას ე.წ რეტროინჰიბირება, ან უარყოფითი უკუკავშირის დათრგუნვა.

ბევრი ფერმენტი წარმოიქმნება არააქტიური პროენზიმის წინამორბედების სახით და შემდეგ აქტიურდება საჭირო დროს ნაწილობრივი პროტეოლიზით. ნაწილობრივი პროტეოლიზი- მოლეკულის ნაწილის დაშლა, რაც იწვევს ცილის მესამეული სტრუქტურის ცვლილებას და ფერმენტის აქტიური ცენტრის წარმოქმნას.

ზოგიერთ ოლიგომერულ ფერმენტს შეუძლია შეცვალოს მათი აქტივობა იმის გამო ასოციაციები - ქვედანაყოფების დისოციაციებიშედის მათ შემადგენლობაში.

ბევრი ფერმენტი გვხვდება ორი ფორმით: როგორც მარტივი ცილა და როგორც ფოსფოპროტეინი. ერთი ფორმიდან მეორეზე გადასვლას თან ახლავს კატალიზური აქტივობის ცვლილება.

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე დამოკიდებულია ფერმენტების რაოდენობა, რომელიც უჯრედში განისაზღვრება მისი სინთეზისა და დაშლის სიჩქარის თანაფარდობით. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის რეგულირების ეს გზა უფრო ნელი პროცესია, ვიდრე ფერმენტის აქტივობის რეგულირება.

ფერმენტული კინეტიკა სწავლობს ფერმენტების მიერ კატალიზებული რეაქციების სიჩქარეს, რაც დამოკიდებულია სუბსტრატთან მათი ურთიერთქმედების სხვადასხვა პირობებზე (კონცენტრაცია, ტემპერატურა, pH და ა.შ.).

თუმცა, ფერმენტები არის ცილები, რომლებიც მგრძნობიარეა სხვადასხვა გარე გავლენის გავლენის მიმართ. ამიტომ ფერმენტული რეაქციების სიჩქარის შესწავლისას, ძირითადად, მხედველობაში მიიღება რეაქტიული ნივთიერებების კონცენტრაციები და ცდილობენ მინიმუმამდე დაიყვანონ ტემპერატურის, გარემოს pH, აქტივატორების, ინჰიბიტორების და სხვა ფაქტორების გავლენა და შეიქმნას სტანდარტული პირობები. პირველ რიგში, ეს არის ამ ფერმენტისთვის გარემოს ოპტიმალური pH. მეორეც, რეკომენდებულია ტემპერატურის შენარჩუნება 25°C-ზე, სადაც ეს შესაძლებელია. მესამე, მიიღწევა ფერმენტის სრული გაჯერება სუბსტრატით. ეს წერტილი განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია, რადგან სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაციის დროს, ყველა ფერმენტის მოლეკულა არ მონაწილეობს რეაქციაში (ნახ. 6.5, ა), რაც ნიშნავს, რომ შედეგი შორს იქნება შესაძლო მაქსიმუმისგან. კატალიზებული რეაქციის უმაღლესი სიმძლავრე, სხვა თანაბარი, მიიღწევა, თუ თითოეული ფერმენტის მოლეკულა მონაწილეობს ტრანსფორმაციაში, ე.ი. ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის მაღალ კონცენტრაციაზე (ნახ. 6.5, in).თუ სუბსტრატის კონცენტრაცია არ უზრუნველყოფს ფერმენტის სრულ გაჯერებას (ნახ. 6.5, ბ), მაშინ მიმდინარე რეაქციის სიჩქარე არ აღწევს მაქსიმალურ მნიშვნელობას.

ბრინჯი. 65.

ა -სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაციის დროს; 6 - სუბსტრატის არასაკმარისი კონცენტრაციით; in -როდესაც ფერმენტი მთლიანად გაჯერებულია სუბსტრატით

ზემოაღნიშნულ პირობებში გაზომილი ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე და სუბსტრატით ფერმენტის სრული გაჯერება ე.წ. ფერმენტული რეაქციის მაქსიმალური სიჩქარე (V).

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე, რომელიც განისაზღვრება მაშინ, როდესაც ფერმენტი არ არის მთლიანად გაჯერებული სუბსტრატით, აღინიშნება ვ.

ფერმენტული კატალიზი შეიძლება მარტივად იყოს აღწერილი სქემით

სადაც F არის ფერმენტი; S - სუბსტრატი; FS - ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი.

ამ პროცესის თითოეული ეტაპი ხასიათდება გარკვეული სიჩქარით. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის საზომი ერთეული არის სუბსტრატის მოლების რაოდენობა, რომლებიც გარდაიქმნება დროის ერთეულში.(როგორც ნორმალური რეაქციის სიჩქარე).

ფერმენტის სუბსტრატთან ურთიერთქმედება იწვევს ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნას, მაგრამ ეს პროცესი შექცევადია. წინა და საპირისპირო რეაქციების სიჩქარე დამოკიდებულია რეაქტიული ნივთიერებების კონცენტრაციაზე და აღწერილია შესაბამისი განტოლებით:

განტოლება (6.3) მოქმედებს წონასწორობაში, რადგან წინა და საპირისპირო რეაქციების სიჩქარე თანაბარია.

პირდაპირი (6.1) და საპირისპირო (6.2) რეაქციების სიჩქარის ჩანაცვლებით (6.3) განტოლებით, მივიღებთ ტოლობას:

წონასწორობის მდგომარეობა ხასიათდება შესაბამისი წონასწორობის მუდმივი K p,უდრის პირდაპირი და საპირისპირო რეაქციების მუდმივთა შეფარდებას (6.5). წონასწორობის მუდმივის ორმხრივი ეწოდება სუბსტრატის მუდმივი K s,ან ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი:

(6.6) განტოლებიდან ირკვევა, რომ სუბსტრატის მუდმივი მცირდება ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის მაღალი კონცენტრაციის დროს, ე.ი. დიდი სტაბილურობით. ამრიგად, სუბსტრატის მუდმივი ახასიათებს ფერმენტისა და სუბსტრატის აფინურობას და სიჩქარის მუდმივთა თანაფარდობას ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნისა და დისოციაციისთვის.

ფერმენტის სუბსტრატით გაჯერების ფენომენი შეისწავლეს ლეონორ მიქაელისმა და მოდ მეპტენმა. შედეგების მათემატიკური დამუშავების საფუძველზე მათ გამოიღეს განტოლება (6.7), რომელმაც მიიღო მათი სახელები, საიდანაც ირკვევა, რომ სუბსტრატის მაღალი კონცენტრაციისა და სუბსტრატის მუდმივის დაბალი მნიშვნელობისას ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე მიდრეკილია. მაქსიმუმამდე. თუმცა, ეს განტოლება შეზღუდულია, რადგან ის არ ითვალისწინებს ყველა პარამეტრს:

ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი რეაქციის დროს შეიძლება განიცადოს ტრანსფორმაციები სხვადასხვა მიმართულებით:

• დაშლა ორიგინალურ ნივთიერებებად;
• გარდაიქმნება პროდუქტად, საიდანაც ფერმენტი გამოყოფილია უცვლელად.

ამიტომ, ფერმენტული პროცესის საერთო ეფექტის აღსაწერად, კონცეფცია მაიკლისის მუდმივები K t,რომელიც გამოხატავს ფერმენტული კატალიზის სამივე რეაქციის სიჩქარის მუდმივთა ურთიერთობას (6.8). თუ ორივე წევრი იყოფა ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნის რეაქციის სიჩქარის მუდმივზე, მაშინ მიიღება გამოთქმა (6.9):

მნიშვნელოვანი დასკვნა გამომდინარეობს განტოლებიდან (6.9): მიქაელის მუდმივა ყოველთვის მეტია სუბსტრატის მუდმივზე k 2 /კვ

რიცხობრივად კ ტუდრის სუბსტრატის ისეთ კონცენტრაციას, რომლის დროსაც რეაქციის სიჩქარე არის მაქსიმალური შესაძლო სიჩქარის ნახევარი და შეესაბამება ფერმენტის ისეთ გაჯერებას სუბსტრატით, როგორც ნახ. 6.5, ბ.ვინაიდან პრაქტიკაში ყოველთვის არ არის შესაძლებელი ფერმენტის სრული გაჯერების მიღწევა სუბსტრატით, ეს ასეა კ ტგამოიყენება ფერმენტების კინეტიკური მახასიათებლების შესადარებლად.

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე სუბსტრატით (6.10) ფერმენტის არასრული გაჯერების შემთხვევაში დამოკიდებულია ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის კონცენტრაციაზე. პროპორციულობის კოეფიციენტი არის რეაქციის მუდმივი ფერმენტისა და პროდუქტის გამოთავისუფლებისთვის, რადგან ეს ცვლის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის კონცენტრაციას:

გარდაქმნების შემდეგ, ზემოთ წარმოდგენილი დამოკიდებულებების გათვალისწინებით, ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე სუბსტრატით არასრული გაჯერების შემთხვევაში აღწერილია განტოლებით (6.11), ე.ი. დამოკიდებულია ფერმენტის, სუბსტრატის კონცენტრაციაზე და მათ აფინურობაზე Ks:

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის გრაფიკული დამოკიდებულება სუბსტრატის კონცენტრაციაზე არ არის წრფივი. როგორც აშკარაა ნახ. 6.6, სუბსტრატის კონცენტრაციის მატებასთან ერთად, შეინიშნება ფერმენტის აქტივობის მატება. თუმცა, როდესაც სუბსტრატით ფერმენტის მაქსიმალური გაჯერება მიიღწევა, ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე მაქსიმალური ხდება. ამიტომ რეაქციის სიჩქარის შემზღუდველი ფაქტორი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნაა.

პრაქტიკამ აჩვენა, რომ სუბსტრატების კონცენტრაციები, როგორც წესი, გამოიხატება ბევრად ნაკლები მნიშვნელობებით, ვიდრე ერთიანობა (10 6 -10 3 მოლი). გამოთვლებში ასეთი რაოდენობით მუშაობა საკმაოდ რთულია. ამიტომ, G. Lineweaver და D. Burke შემოგვთავაზეს ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის გრაფიკული დამოკიდებულების გამოხატვა არა პირდაპირ კოორდინატებში, არამედ საპირისპიროში. ისინი გამოვიდნენ დაშვებიდან, რომ თანაბარი მნიშვნელობებისთვის, მათი ორმხრივები ასევე ტოლია:

ბრინჯი. 6.6.

გამოხატვის (6.13) ტრანსფორმაციის შემდეგ მიიღება გამონათქვამი, ე.წ ლაინვივერ-ბურკის განტოლება (6.14):

Lineweaver-Burk განტოლების გრაფიკული დამოკიდებულება წრფივია (ნახ. 6.7). ფერმენტის კინეტიკური მახასიათებლები განისაზღვრება შემდეგნაირად:

• y-ღერძზე მოწყვეტილი სეგმენტი უდრის 1/V;
• x ღერძზე მოწყვეტილი სეგმენტი არის -1 /კ ტ.

ბრინჯი. 6.7.

ითვლება, რომ Lineweaver - Burke მეთოდი საშუალებას გაძლევთ უფრო ზუსტად განსაზღვროთ რეაქციის მაქსიმალური სიჩქარე, ვიდრე პირდაპირ კოორდინატებში. ღირებული ინფორმაცია ფერმენტების დათრგუნვის შესახებ ასევე შეიძლება ამოღებული იყოს ამ გრაფიკიდან.

მიქაელის-მენტენის განტოლების გარდაქმნის სხვა გზებიც არსებობს. გრაფიკული დამოკიდებულებები გამოიყენება ფერმენტულ პროცესზე სხვადასხვა გარეგანი გავლენის გავლენის შესასწავლად.

ფერმენტოლოგიის ეს განყოფილება სწავლობს სხვადასხვა ფაქტორების გავლენას ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე. ერთი სუბსტრატის ერთ პროდუქტად გადაქცევის შექცევადი რეაქციის ფერმენტული კატალიზის ზოგადი განტოლების გათვალისწინებით (1),

ძირითადი ფაქტორები, რომლებიც გავლენას ახდენენ ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე, უნდა დასახელდეს: სუბსტრატის კონცენტრაცია [S], ფერმენტის კონცენტრაცია [E] და რეაქციის პროდუქტის კონცენტრაცია [P].

ზოგიერთი ფერმენტის ურთიერთქმედება მათ სუბსტრატთან შეიძლება აღწერილი იყოს ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის V-ის დამოკიდებულების ჰიპერბოლური მრუდით სუბსტრატის [S] კონცენტრაციაზე (ნახ. 19):

სურ. 19. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება სუბსტრატის კონცენტრაციაზე.

ამ მრუდზე შეიძლება გამოიყოს სამი სეგმენტი, რაც აიხსნება ფერმენტის სუბსტრატთან ურთიერთქმედების მექანიზმის პოზიციებით: OA არის V-ის პირდაპირპროპორციული დამოკიდებულების სეგმენტი [S]-ზე, ფერმენტის აქტიურ უბნებზე. თანდათან ივსება სუბსტრატის მოლეკულებით არასტაბილური კომპლექსური ES-ის წარმოქმნით; სექცია AB - V-ის მრუდი დამოკიდებულება [S]-ზე, ფერმენტის აქტიური ცენტრების სრული გაჯერება სუბსტრატის მოლეკულებით ჯერ არ არის მიღწეული. ES კომპლექსი გარდამავალ მდგომარეობამდე არამდგრადია, უკანა დისოციაციის ალბათობა E და S-მდე ჯერ კიდევ მაღალია; მონაკვეთი BC - დამოკიდებულება აღწერილია ნულოვანი რიგის განტოლებით, მონაკვეთი არის [S] ღერძის პარალელურად, მიღწეულია აქტიური ფერმენტების სრული გაჯერება სუბსტრატის მოლეკულებით, V=V max .

მრუდის დამახასიათებელი ფორმა მათემატიკურად არის აღწერილი ბრიგს-ჰალდანის განტოლებით:

V=V მაქსიმალური ● [S]/კმ + [S] (2),

სადაც Km არის მიქაელის-მენტენის მუდმივი, რიცხობრივად ტოლია სუბსტრატის კონცენტრაციისა, რომლის დროსაც ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე უდრის ნახევარ V max.

რაც უფრო დაბალია ფერმენტის Km, მით უფრო მაღალია ფერმენტის აფინურობა სუბსტრატთან, მით უფრო სწრაფად მიიღწევა სუბსტრატის გარდამავალი მდგომარეობა და ის გადაიქცევა რეაქციის პროდუქტად. Km მნიშვნელობების ძიება ჯგუფური სპეციფიკის მქონე ფერმენტის თითოეული სუბსტრატისთვის მნიშვნელოვანია ამ ფერმენტის ბიოლოგიური როლის განსაზღვრაში უჯრედში.

ფერმენტების უმრავლესობისთვის შეუძლებელია ჰიპერბოლური მრუდის აგება (ნახ. 19) ამ შემთხვევაში გამოიყენება ორმაგი ორმხრივი მეთოდი (Lineweaver-Burk), ე.ი. გამოსახულია 1/[V]-ის გრაფიკული დამოკიდებულება 1/[S]-ზე (სურ. 20). ექსპერიმენტში ასეთი მრუდების აგების მეთოდი ძალიან მოსახერხებელია ფერმენტების აქტივობაზე სხვადასხვა ტიპის ინჰიბიტორების ზემოქმედების შესწავლისას (იხილეთ ტექსტი ქვემოთ).

სურ.20. ნაკვეთი 1/[V] წინააღმდეგ 1/[S] (Lineweaver-Burk მეთოდი),

სადაც y-გაწყვეტის არე - , და x - კვეთის არე - , კუთხის α - ტანგენსი.

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის V დამოკიდებულება ფერმენტის კონცენტრაციაზე [E].

ეს გრაფიკული დამოკიდებულება (ნახ. 21) განიხილება გარემოს ოპტიმალურ ტემპერატურასა და pH-ზე, სუბსტრატის კონცენტრაციებზე, რომლებიც მნიშვნელოვნად აღემატება ფერმენტის აქტიური უბნების გაჯერების კონცენტრაციას.

ბრინჯი. 21. ფერმენტის კონცენტრაციის გავლენა ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე.

ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება კოფაქტორის ან კოენზიმის კონცენტრაციაზე.კომპლექსური ფერმენტებისთვის უნდა გავითვალისწინოთ, რომ ჰიპოვიტამინოზის დროს ვიტამინების კოენზიმური ფორმების დეფიციტი, ორგანიზმში ლითონის იონების შეყვანის დარღვევა აუცილებლად იწვევს მეტაბოლური მიმდინარეობისთვის საჭირო შესაბამისი ფერმენტების კონცენტრაციის დაქვეითებას. პროცესები. აქედან გამომდინარე, უნდა დავასკვნათ, რომ ფერმენტის აქტივობა პირდაპირ არის დამოკიდებული კოფაქტორის ან კოენზიმის კონცენტრაციაზე.

პროდუქტების კონცენტრაციის გავლენა ფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე.ადამიანის ორგანიზმში წარმოქმნილი შექცევადი რეაქციებისთვის მხედველობაში უნდა იქნას მიღებული, რომ პირდაპირი რეაქციის პროდუქტები ფერმენტმა შეიძლება გამოიყენოს საპირისპირო რეაქციის სუბსტრატებად. ამრიგად, დინების მიმართულება და V max-ის მიღწევის მომენტი დამოკიდებულია საწყისი სუბსტრატებისა და რეაქციის პროდუქტების კონცენტრაციების თანაფარდობაზე. მაგალითად, ალანინ ამინოტრანსფერაზას აქტივობა, რომელიც ახდენს ტრანსფორმაციის კატალიზებას:

ალანინი + ალფა-კეტოგლუტარატი ↔ პირუვატი + გლუტამატი

დამოკიდებულია უჯრედში კონცენტრაციების თანაფარდობაზე:

[ალანინი + ალფა-კეტოგლუტარატი] / [პირუვატი + გლუტამატი].

ფერმენტების მოქმედების მექანიზმი. ფერმენტული კატალიზის თეორიები

ფერმენტები, ისევე როგორც არაცილოვანი კატალიზატორები, ზრდის ქიმიური რეაქციის სიჩქარეს ამ რეაქციის აქტივაციის ენერგიის შემცირების უნარის გამო. ფერმენტული რეაქციის აქტივაციის ენერგია გამოითვლება, როგორც სხვაობა მიმდინარე რეაქციის სისტემაში ენერგიის მნიშვნელობასა და რეაქციის დასაწყისში განსაზღვრულ ენერგიას შორის (იხ. გრაფიკული დამოკიდებულება ნახ. 22).

ბრინჯი. 22. ქიმიური რეაქციის ენერგეტიკული მდგომარეობის გრაფიკული დამოკიდებულება ფერმენტის გარეშე (1) და ფერმენტის (2) არსებობისას რეაქციის დროზე.

ვ. ჰენრის და, კერძოდ, ლ. მიქაელისის, მ. მენტენის ნაშრომებმა მონოსუბსტრატის შექცევადი ფერმენტული რეაქციების მექანიზმის შესწავლის შესახებ შესაძლებელი გახადა დადგინდეს, რომ ფერმენტ E პირველად შექცევადად და შედარებით სწრაფად ერწყმის თავის სუბსტრატს S-ს და წარმოიქმნება. ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი (ES):

E+S<=>ES (1)

ES-ის წარმოქმნა ხდება წყალბადის ბმების, ელექტროსტატიკური, ჰიდროფობიური ურთიერთქმედების, ზოგიერთ შემთხვევაში კოვალენტური, საკოორდინაციო ბმების გამო, აქტიური ცენტრის ამინომჟავის ნარჩენების გვერდით რადიკალებსა და სუბსტრატის ფუნქციურ ჯგუფებს შორის. კომპლექსურ ფერმენტებში სტრუქტურის არაცილოვან ნაწილს ასევე შეუძლია შეასრულოს სუბსტრატთან კონტაქტის ფუნქცია.

შემდეგ ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი იშლება მეორე უფრო ნელ შექცევად რეაქციაში, რათა წარმოქმნას რეაქციის პროდუქტი P და თავისუფალი ფერმენტი E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

დღეისათვის, ზემოაღნიშნული მეცნიერების, ისევე როგორც Kaylin D., Chance B., Koshland D. („გამოწვეული შესაბამისობის თეორია“) მუშაობის წყალობით, არსებობს თეორიული დებულებები ოთხი ძირითადი პუნქტის მექანიზმში. ფერმენტის მოქმედება სუბსტრატზე, რომელიც განსაზღვრავს ფერმენტების უნარს დააჩქაროს ქიმიური რეაქციები.რეაქციები:

1. ორიენტაცია და სიახლოვე . ფერმენტს შეუძლია სუბსტრატის მოლეკულის შებოჭვა ისე, რომ ფერმენტის მიერ თავდასხმული ბმა არა მხოლოდ კატალიზური ჯგუფის უშუალო სიახლოვეს მდებარეობს, არამედ სწორად არის ორიენტირებული მის მიმართ. საგრძნობლად გაიზარდა ალბათობა იმისა, რომ ES კომპლექსი მიაღწიოს გარდამავალ მდგომარეობას ორიენტაციისა და მიდგომის გამო.

2. სტრესი და დაძაბულობა : გამოწვეული მორგება. სუბსტრატის მიმაგრებამ შეიძლება გამოიწვიოს ფერმენტის მოლეკულაში კონფორმაციული ცვლილებები, რაც იწვევს აქტიური ადგილის სტრუქტურაში დაძაბულობას, აგრეთვე შეკრული სუბსტრატის გარკვეულ დეფორმაციას, რითაც ხელს უწყობს ES კომპლექსის მიერ გარდამავალი მდგომარეობის მიღწევას. E და S მოლეკულებს შორის არის ეგრეთ წოდებული ინდუცირებული კორესპონდენცია.

საკურსო სამუშაო

ფერმენტული რეაქციების კინეტიკა

შესავალი

ნებისმიერი ორგანიზმის სიცოცხლის საფუძველია ქიმიური პროცესები. ცოცხალ ორგანიზმში თითქმის ყველა რეაქცია მიმდინარეობს ბუნებრივი ბიოკატალიზატორების - ფერმენტების მონაწილეობით.

ბერცელიუსმა 1835 წელს პირველად გამოთქვა ვარაუდი, რომ ცოცხალი ორგანიზმის რეაქციები წარმოებს ახალი ძალის გამო, რომელსაც მან უწოდა "კატალიტიკური". მან ეს აზრი ძირითადად ექსპერიმენტული დაკვირვებით დაასაბუთა: კარტოფილის დიასტაზა სახამებელს უფრო სწრაფად ჰიდროლიზებს, ვიდრე გოგირდის მჟავა. ჯერ კიდევ 1878 წელს კუჰნემ ნივთიერებას, რომელსაც ცოცხალ ორგანიზმში კატალიზური ძალა აქვს, ფერმენტი უწოდა.

ფერმენტის მოქმედების კინეტიკა არის ფერმენტოლოგიის ფილიალი, რომელიც სწავლობს ფერმენტების მიერ კატალიზებული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულებას სუბსტრატის ფერმენტთან ურთიერთქმედების ქიმიურ ბუნებასა და პირობებზე, აგრეთვე გარემო ფაქტორებზე. სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, ფერმენტების კინეტიკა საშუალებას იძლევა გავიგოთ ფაქტორების მოქმედების მოლეკულური მექანიზმების ბუნება, რომლებიც გავლენას ახდენენ ფერმენტული კატალიზის სიჩქარეზე. ეს განყოფილება ჩამოყალიბდა ისეთი მეცნიერებების კვეთაზე, როგორიცაა ბიოქიმია, ფიზიკა და მათემატიკა. ფერმენტული რეაქციების მათემატიკურად აღწერის ყველაზე ადრეული მცდელობა განხორციელდა დუკლოს მიერ 1898 წელს.

სინამდვილეში, ფერმენტების შესწავლის ეს განყოფილება ძალიან მნიშვნელოვანია ჩვენს დროში, კერძოდ, პრაქტიკული მედიცინისთვის. ის ფარმაკოლოგებს აძლევს საშუალებას შეცვალონ უჯრედული მეტაბოლიზმი, დიდი რაოდენობით ფარმაცევტული საშუალებები და სხვადასხვა შხამები - ეს არის ფერმენტის ინჰიბიტორები.

ამ ნაშრომის მიზანია განიხილოს საკითხი რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულების შესახებ სხვადასხვა ფაქტორებზე, როგორ შეიძლება რეაქციის სიჩქარის კონტროლი და როგორ შეიძლება განისაზღვროს.

1. მიქაელის-მენტენის კინეტიკა

ფერმენტული რეაქციების კინეტიკის შესწავლის წინასწარმა ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ რეაქციის სიჩქარე, თეორიული მოლოდინის საწინააღმდეგოდ, არ არის დამოკიდებული ფერმენტის (E) და სუბსტრატის (S) კონცენტრაციაზე ისე, როგორც ჩვეულებრივი. მეორე რიგის რეაქცია.

ბრაუნმა და მისგან დამოუკიდებლად ჰენრიმ პირველებმა წამოაყენეს ჰიპოთეზა რეაქციის დროს ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნის შესახებ. შემდეგ ეს ვარაუდი დადასტურდა სამი ექსპერიმენტული ფაქტით:

ა) პაპაინმა წარმოქმნა უხსნადი ნაერთი ფიბრინით (Wurtz, 1880);

ბ) ინვერტაზას სუბსტრატის საქაროზას შეუძლია დაიცვას ფერმენტი თერმული დენატურაციისგან (O'Sullivan and Thompson, 1890);

გ) ფერმენტები ნაჩვენებია, როგორც სტერეოქიმიურად სპეციფიკური კატალიზატორები (Fischer, 1898-1899).

მათ შემოიტანეს მაქსიმალური სიჩქარის კონცეფცია და აჩვენეს ეს გაჯერების მრუდი(ანუ რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება სუბსტრატის კონცენტრაციაზე) არის ტოლფერდა ჰიპერბოლა. მათ დაამტკიცეს, რომ მაქსიმალური დაკვირვების სიჩქარე არის მრუდის ერთ-ერთი ასიმპტოტი, ხოლო x-ღერძზე (მისი უარყოფითი მნიშვნელობების რეგიონში) მოწყვეტილი სეგმენტი მეორე ასიმპტოტით, ე.ი. მუდმივი სიჩქარის განტოლებაში, აბსოლუტური მნიშვნელობით უდრის სუბსტრატის კონცენტრაციას, რომელიც საჭიროა მაქსიმალური სიჩქარის ნახევრის მისაღწევად.

მიქაელისმა და მენტენმა ვარაუდობდნენ, რომ რეაქციის სიჩქარე განისაზღვრება ES კომპლექსის დაშლით, ე.ი. მუდმივი k 2 . ეს შესაძლებელია მხოლოდ იმ პირობით, რომ k 2 სიჩქარის მუდმივებიდან ყველაზე პატარაა. ამ შემთხვევაში, წონასწორობა ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსს, თავისუფალ ფერმენტსა და სუბსტრატს შორის სწრაფად მყარდება რეაქციის სიჩქარესთან შედარებით (სწრაფი წონასწორობა).

საწყისი რეაქციის სიჩქარე შეიძლება გამოიხატოს შემდეგი ფორმულით:

v = k2

ვინაიდან ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი არის

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

მაშინ თავისუფალი ფერმენტის კონცენტრაცია შეიძლება გამოიხატოს როგორც

[E]=K S / [S]

რეაქციულ ნარევში ფერმენტის მთლიანი კონცენტრაცია განისაზღვრება ფორმულით

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

რეაქცია აღწევს მაქსიმალურ სიჩქარეს, როდესაც სუბსტრატის კონცენტრაცია საკმარისად მაღალია, რომ ყველა ფერმენტის მოლეკულა იყოს ES კომპლექსის სახით (სუბსტრატის უსასრულოდ დიდი ჭარბი). საწყისი სიჩქარის შეფარდება თეორიულად შესაძლო მაქსიმალურ სიჩქარესთან უდრის [ES]-ის [E] t-ის შეფარდებას:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

ეს არის კლასიკური განტოლება მიქაელისდა მენტენი,რომელიც 1913 წელს გამოქვეყნებიდან დღემდე იყო ყველა ფერმენტის კინეტიკური კვლევის ფუნდამენტური პრინციპი და, გარკვეული შეზღუდვებით, ასე დარჩა დღემდე.

მოგვიანებით აჩვენეს, რომ მიქაელის-მენტენის თავდაპირველ განტოლებას რამდენიმე შეზღუდვა ჰქონდა. სამართლიანია, ე.ი. სწორად აღწერს ამ ფერმენტის მიერ კატალიზებული რეაქციის კინეტიკას მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ დაკმაყოფილებულია ყველა შემდეგი შემზღუდველი პირობა:

) წარმოიქმნება კინეტიკურად სტაბილური ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი;

) მუდმივი K S არის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი: ეს მართალია მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ;

) რეაქციის დროს სუბსტრატის კონცენტრაცია არ იცვლება, ე.ი. თავისუფალი სუბსტრატის კონცენტრაცია მისი საწყისი კონცენტრაციის ტოლია;

) რეაქციის პროდუქტი სწრაფად იშლება ფერმენტისგან, ე.ი. არ წარმოიქმნება ES კომპლექსის კინეტიკურად მნიშვნელოვანი რაოდენობა;

) რეაქციის მეორე ეტაპი შეუქცევადია; უფრო ზუსტად, ჩვენ გავითვალისწინებთ მხოლოდ საწყის სიჩქარეს, როდესაც უკანა რეაქცია (პროდუქტის ფაქტობრივი ნაკლებობის გამო) მაინც შეიძლება უგულებელვყოთ;

) მხოლოდ ერთი სუბსტრატის მოლეკულა უკავშირდება ფერმენტის თითოეულ აქტიურ ადგილს;

) ყველა რეაგენტისთვის, მათი კონცენტრაციები შეიძლება გამოყენებულ იქნას აქტივობის ნაცვლად.

მიქაელის-მენტენის განტოლება ემსახურება როგორც საწყისი წერტილი ფერმენტების მოქმედების ნებისმიერი რაოდენობრივი აღწერისთვის. ხაზგასმით უნდა აღინიშნოს, რომ ფერმენტების უმრავლესობის კინეტიკური ქცევა ბევრად უფრო რთულია, ვიდრე ეს გამომდინარეობს იდეალიზებული სქემიდან, რომელიც ემყარება მაიკლის-მენტენის განტოლებას. ამ განტოლების გამოყვანისას ვარაუდობენ, რომ არსებობს მხოლოდ ერთი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი. იმავდროულად, სინამდვილეში, უმეტეს ფერმენტულ რეაქციაში, სულ მცირე ორი ან სამი ასეთი კომპლექსი იქმნება, რომლებიც წარმოიქმნება გარკვეული თანმიმდევრობით.

აქ EZ აღნიშნავს კომპლექსს, რომელიც შეესაბამება ჭეშმარიტ გარდამავალ მდგომარეობას, ხოლო EP აღნიშნავს კომპლექსს ფერმენტსა და რეაქციის პროდუქტს შორის. ასევე შეიძლება აღინიშნოს, რომ უმეტეს ფერმენტულ რეაქციაში ერთზე მეტი სუბსტრატი მონაწილეობს და შესაბამისად წარმოიქმნება ორი ან მეტი პროდუქტი. რეაქციაში ორ სუბსტრატთან, S 1 და S 2 , შეიძლება წარმოიქმნას სამი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი, კერძოდ ES 1 , ES 2 და ES 1 S 2 . თუ რეაქცია წარმოქმნის ორ პროდუქტს, P 1 და P 2 , მაშინ შეიძლება იყოს მინიმუმ სამი დამატებითი კომპლექსი EP 1 , EP 2 და EP 1 P 2 . ასეთ რეაქციებში არის მრავალი შუალედური საფეხური, რომელთაგან თითოეული ხასიათდება საკუთარი სიჩქარის მუდმივით. ფერმენტული რეაქციების კინეტიკური ანალიზი, რომელიც მოიცავს ორ ან მეტ რეაქტანტს, ხშირად უკიდურესად რთულია და მოითხოვს ელექტრონული კომპიუტერების გამოყენებას. თუმცა, ყველა ფერმენტული რეაქციის კინეტიკის გაანალიზებისას, ამოსავალი წერტილი ყოველთვის არის ზემოთ განხილული მიქაელის-მენტენის განტოლება.

1.1 მუდმივის ბუნებაკგანტოლებაში

განტოლება ფერმენტული რეაქციის კინეტიკა

მეორე პოსტულატში ნათქვამია, რომ მუდმივი K S განტოლებაში არის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი.

ბრიგსმა და ჰალდანმა 1925 წელს დაამტკიცეს, რომ ორიგინალური მიქაელის-მენტენის განტოლება მოქმედებს მხოლოდ , ე.ი. როდესაც ელემენტარული საფეხურის E+S ES წონასწორობა მყარდება ძალიან სწრაფად მომდევნო ეტაპის სიჩქარესთან შედარებით. მაშასადამე, ასეთ კინეტიკურ მექანიზმებს (მიქაელის-მენტენის საწყის მდგომარეობას ემორჩილება და აქვს ერთი ნელი ელემენტარული ეტაპი, რომლის მიმართაც წონასწორობა ყველა სხვა ელემენტარულ საფეხურზე სწრაფად მყარდება) ეწოდება "სწრაფი წონასწორობის" დაშვების დაკმაყოფილებას. თუმცა, თუ k 2 შედარებადია k -1-ის სიდიდის მიხედვით , ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის კონცენტრაციის ცვლილება დროთა განმავლობაში შეიძლება გამოიხატოს შემდეგი დიფერენციალური განტოლებით:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

ვინაიდან ჩვენ განვიხილავთ საწყისი რეაქციის სიჩქარეს, ე.ი. მომენტი, როდესაც საპირისპირო რეაქცია ჯერ არ ხდება და წინასწარ სტაციონარული ეტაპი უკვე გავლილია, მაშინ სუბსტრატის სიჭარბის გამო წარმოქმნილი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის რაოდენობა უდრის დაშლილის რაოდენობას. (სტაციონარული პრინციპი, ან ბრიგსის და ჰალდანის კინეტიკა, ან ბოდენშტეინის პრინციპი ქიმიურ კინეტიკაში) და მართალია, რომ

d/dt=0

ამის დიფერენციალურ განტოლებაში ჩანაცვლებით, ჩვენ ვიღებთ გამოხატულებას თავისუფალი ფერმენტის კონცენტრაციისთვის:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

სტაბილური მდგომარეობის განტოლება:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

რადგან v = k 2, მაშინ მივიღებთ ამას

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

Ამ შემთხვევაში

V max = k 2 [E] T

და უდრის მაიკლის-მენტენის განტოლებიდან მიღებულ მაქსიმალურ სიჩქარეს. თუმცა, მიქაელის-მენტენის განტოლების მნიშვნელში მუდმივი არ არის K S , იმათ. ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის არა დისოციაციის მუდმივი, არამედ ე.წ მიქაელის მუდმივი:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m უდრის K S-ს მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ .

იმ შემთხვევაში, სიჩქარის განტოლების მნიშვნელში მუდმივი გამოიხატება ფორმულით

K k \u003d k 2 / k 1

და ეწოდება, ვან სლაიკის მიხედვით, კინეტიკური მუდმივი.

სტაბილური მდგომარეობის განტოლება ასევე შეიძლება მივიღოთ დიფერენციალური განტოლებიდან იმ დაშვების გარეშე, რომ d/dt = 0. თუ [E] = [E] T - მნიშვნელობას ჩავანაცვლებთ დიფერენციალურ განტოლებაში, გარდაქმნების შემდეგ მივიღებთ

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

იმისათვის რომ მივიღოთ სტაბილური მდგომარეობის განტოლება ამ განტოლებიდან, ის არ უნდა იყოს d/dt = 0. საკმარისია, რომ უტოლობა d/dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

დიფერენცირებული სტაბილური მდგომარეობის განტოლება ასე გამოიყურება:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

ეს გამოთქმა აშკარად არ უდრის 0-ს.

1.2 მიქაელის-მენტენის განტოლების ტრანსფორმაცია

ორიგინალური მიქაელის-მენტენის განტოლება არის ჰიპერბოლური განტოლება, სადაც ერთ-ერთი მუდმივი (V max) არის მრუდის ასიმპტოტი. კიდევ ერთი მუდმივი (Km), რომლის უარყოფითი მნიშვნელობა განისაზღვრება მეორე ასიმპტოტით, უდრის სუბსტრატის კონცენტრაციას, რომელიც საჭიროა V max/2-ის მისაღწევად. ამის შემოწმება ადვილია, რადგან თუ

v=Vmax / 2, მაშინ

Vmax / 2 = Vmax [S] / (კმ + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], ე.ი. [S] = K m v = V max /2.

მიქაელის-მენტენის განტოლება შეიძლება ალგებრულად გარდაიქმნას სხვა ფორმებად, რომლებიც უფრო მოსახერხებელია ექსპერიმენტული მონაცემების გრაფიკული წარმოდგენისთვის. ერთ-ერთი ყველაზე გავრცელებული ტრანსფორმაცია არის განტოლების მარცხენა და მარჯვენა მხარის ორმხრივების გათანაბრება.

ტრანსფორმაციის შედეგად ვიღებთ გამონათქვამს

რომელიც სახელს ატარებს ლაინვივერ-ბურკის განტოლებები. ამ განტოლების მიხედვით, 1/[S] და 1/v კოორდინატებში გამოსახული გრაფიკი არის სწორი ხაზი, რომლის დახრილობა უდრის Km/V max-ს, ხოლო y-ღერძზე ამოჭრილი სეგმენტი ტოლია. მაქსიმუმ 1/V-მდე. ასეთ ორმაგ ორმხრივ გრაფიკს აქვს უპირატესობა, რომ შესაძლებელს ხდის V max უფრო ზუსტად განსაზღვროს; [S] და v კოორდინატებში გამოსახულ მრუდზე V max არის ასიმპტომური სიდიდე და გაცილებით ნაკლებად ზუსტად არის განსაზღვრული. X ღერძზე მოწყვეტილი სეგმენტი Lineweaver-Burk ნაკვეთზე უდრის -1/Km. ღირებული ინფორმაცია ფერმენტების დათრგუნვის შესახებ ასევე შეიძლება ამოღებული იყოს ამ გრაფიკიდან.

მაიკლის-მენტენის განტოლების კიდევ ერთი ტრანსფორმაცია არის ის, რომ ლაინვივერ-ბურკის განტოლების ორივე მხარე მრავლდება V max *v-ზე და რამდენიმე დამატებითი გარდაქმნების შემდეგ მივიღებთ

v და v/[S] კოორდინატებში შესაბამისი ნაკვეთი წარმოადგენს e 4, ნახ. ერთი]. ასეთი გრაფიკი ( Edie-Hofsty ჩარტში) არა მხოლოდ შესაძლებელს ხდის ძალიან მარტივად განსაზღვროთ V max და Km მნიშვნელობები, არამედ საშუალებას გაძლევთ განსაზღვროთ შესაძლო გადახრები წრფივისაგან, რომლებიც არ არის გამოვლენილი Lineweaver-Burk ნაკვეთზე.

განტოლება ასევე შეიძლება იყოს ხაზოვანი სხვა ფორმით

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

ამ შემთხვევაში, უნდა აშენდეს დამოკიდებულება [S] / v [S]-ზე. მიღებული სწორი ხაზის დახრილობა არის 1/V max; ორდინატებზე და აბსცისის ღერძებზე ამოჭრილი სეგმენტები ტოლია (K m/V max) და (- K m), შესაბამისად. ეს სქემა ავტორის სახელს ატარებს ჰეინსის სქემა.

სტატისტიკურმა ანალიზმა აჩვენა, რომ Edie-Hofstee და Haynes მეთოდები იძლევა უფრო ზუსტ შედეგებს, ვიდრე Lineweaver-Burk მეთოდი. ამის მიზეზი ის არის, რომ Edie - Hofstee-სა და Haynes-ის გრაფიკებში ორივე დამოკიდებული და დამოუკიდებელი ცვლადები შედის ორივე კოორდინატულ ღერძზე გამოსახულ მნიშვნელობებში.

1.3 სუბსტრატის კონცენტრაციის ეფექტი რეაქციის კინეტიკაზე

ხშირ შემთხვევაში სუბსტრატის მუდმივი კონცენტრაციის პირობა არ არის დაკმაყოფილებული. ერთის მხრივ, სუბსტრატის ჭარბი რაოდენობა არ გამოიყენება ზოგიერთ ფერმენტთან ინ ვიტრო რეაქციაში სუბსტრატის ფერმენტული აქტივობის ხშირად დათრგუნვის გამო. ამ შემთხვევაში, შესაძლებელია მხოლოდ მისი ოპტიმალური კონცენტრაციის გამოყენება და ეს ყოველთვის არ იძლევა სუბსტრატის ჭარბი რაოდენობას, რომელიც აუცილებელია ზემოთ განხილული მექანიზმების კინეტიკური განტოლებების შესასრულებლად. უფრო მეტიც, უჯრედში in vivo, ამ პირობის შესასრულებლად საჭირო სუბსტრატის ჭარბი რაოდენობა ჩვეულებრივ არ მიიღწევა.

ფერმენტულ რეაქციებში, სადაც სუბსტრატი არ არის ჭარბი და, შესაბამისად, მისი კონცენტრაცია იცვლება რეაქციის დროს, ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივია.

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - სუბსტრატის კონცენტრაცია t = 0-ზე). ამ შემთხვევაში, საწყისი რეაქციის სიჩქარე (სტაბილურ მდგომარეობაში) მოცემულია

v= V max / (K m +)

სად არის სუბსტრატის კონცენტრაცია დროის მომენტში.

თუმცა, შესაძლებელია დაწეროთ სავარაუდო ამონახსნები ორი შემთხვევისთვის, სადაც [S] o = :

) თუ ეს უტოლობა დაკმაყოფილებულია t-ის დიდი მნიშვნელობების გამო, ე.ი. როდესაც რეაქციის დროს მოიხმარა სუბსტრატის საწყისი კონცენტრაციის 5%-ზე მეტი;

) თუ ფერმენტის კონცენტრაციის უგულებელყოფა არ შეიძლება სუბსტრატის კონცენტრაციასთან შედარებით და ამდენად უნდა იქნას გათვალისწინებული ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის კონცენტრაცია.

თუ t დიდია და კონცენტრაცია უმნიშვნელოა [S] 0-თან შედარებით, მაშინ ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივის განტოლება ხდება შემდეგი:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

კონცენტრაციის მნიშვნელობისთვის, რომელიც იცვლება რეაქციის დროს, მნიშვნელობა ([S] 0 + )/2 დამაკმაყოფილებელ მიახლოებას ემსახურება. ვინაიდან = [S] 0 - [P], საშუალო სიჩქარე; შეიძლება გამოიხატოს როგორც

ამ გამოხატვისა და სავარაუდო მნიშვნელობის ჩანაცვლება

v= V max / (K m +),

ჩვენ ვიღებთ:

ამ მიახლოების საფუძველზე გამოთვლილი მნიშვნელობების შედარებისას ზუსტი, ინტეგრირებული მიქაელის-მენტენის განტოლებიდან მიღებულ მნიშვნელობებთან, აღმოჩნდება, რომ შეცდომა Km-ის განსაზღვრისას. არის 1 და 4% სუბსტრატის 30 და 50%-ის დახარჯვისას შესაბამისად. ამიტომ, ამ მიახლოების შეცდომა უმნიშვნელოა გაზომვის შეცდომასთან შედარებით.

როდესაც სუბსტრატის მოხმარება არ აღემატება საწყისი კონცენტრაციის 5%-ს, მაგრამ ფერმენტის კონცენტრაცია იმდენად მაღალია, რომ მისი იგნორირება შეუძლებელია [S] 0-თან შედარებით, ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი ტოლია:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

მისი გადაწყვეტა რაც შეეხება იძლევა

ორი შესაძლო ამოხსნიდან მხოლოდ უარყოფითი შეიძლება აირჩეს, რადგან მხოლოდ ის აკმაყოფილებს საწყის პირობებს: = 0 [S] 0 = 0-ზე ან [E] T = 0. v/V თანაფარდობის განტოლების ანალოგიით. max, მივიღეთ საწყისი სიჩქარის განტოლება. ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივის განტოლებიდან მიღებული კვადრატული განტოლება, რომელიც ნაპოვნია ოდნავ უფრო მაღალი, v \u003d k 2 და V max \u003d k 2 [E] T ფორმულების გამოყენებით, შეიძლება შემცირდეს შემდეგ ფორმამდე. :

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

გასათვალისწინებელია ორი შემზღუდველი შემთხვევა. პირველ შემთხვევაში [S]<

v = (Vmax / კმ) [S] = k[S]

ამრიგად, მივიღეთ პირველი რიგის მოჩვენებითი რეაქცია და k=V max /K m - აშკარა პირველი რიგის კინეტიკური მუდმივი. მისი რეალური განზომილება არის დრო -1, მაგრამ ეს არის რამდენიმე ელემენტარული საფეხურის პირველი და მეორე რიგის სიჩქარის მუდმივების კომბინაცია, ე.ი. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . აშკარა პირველი რიგის პირობებში კ არის რეაქციის პროგრესის საზომი.

კიდევ ერთი შემზღუდველი შემთხვევა: [S] >> კ მ . აქ მუდმივი K m უმნიშვნელოა [S]-თან შედარებით და ამით ვიღებთ v = V max.

1.4 კინეტიკურად სტაბილური ფერმენტ-პროდუქტის კომპლექსის ფორმირება

თუ რეაქციის დროს წარმოიქმნება კინეტიკურად სტაბილური ფერმენტ-პროდუქტის კომპლექსი, რეაქციის მექანიზმი შემდეგია:

სტაბილური მდგომარეობის დაშვების გამოყენებით, ჩვენ შეგვიძლია დავწეროთ დიფერენციალური განტოლებები:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

ამ განტოლებიდან გამომდინარეობს, რომ

= [(კ -2 + კ 3) / კ 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

ვინაიდან v = k 3

და [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

ვიღებთ

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)] = k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

ე.ი

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

ამ შემთხვევაში, უკვე ძალიან რთულია ინდივიდუალური სიჩქარის მუდმივების სპეციფიკური მნიშვნელობების გამოთვლა, რადგან მხოლოდ მათი თანაფარდობა შეიძლება პირდაპირ გაიზომოს. სიტუაცია კიდევ უფრო რთულდება, როდესაც ფერმენტული რეაქციის მექანიზმი რთულდება, როდესაც რეაქციაში ორზე მეტი კომპლექსია ჩართული, რადგან განტოლებაში სიჩქარის მუდმივთა რაოდენობა, რა თქმა უნდა, გაცილებით დიდია და მათი თანაფარდობაც. უფრო რთული.

თუმცა, სიტუაცია გამარტივებულია, თუ პირველი კომპლექსის წარმოქმნის შექცევადი რეაქციის შემდეგ, შემდგომი ელემენტარული საფეხურები შეუქცევადია. ფერმენტების მნიშვნელოვანი წარმომადგენლები, რომლებიც ემორჩილებიან ამ მექანიზმს, არიან პროტეოლიზური ფერმენტები და ესთერაზები. მათი რეაქციის მექანიზმი შეიძლება დაიწეროს შემდეგნაირად:

სადაც ES` არის აცილ-ფერმენტის შუალედური ნივთიერება, რომელიც იშლება წყლის ზემოქმედებისას. შეგვიძლია დავწეროთ

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) \u003d k კატა [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 კატა / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

აცილირების საფეხურის მიქაელის მუდმივი არის Km "K s. რაც უფრო დიდია თანაფარდობა k cat/Km, მით უფრო მაღალია სუბსტრატის სპეციფიკა.

მუდმივების განსაზღვრა მნიშვნელოვნად გამარტივებულია, თუ ექსპერიმენტი ჩატარდება ნუკლეოფილური აგენტის (N) თანდასწრებით, რომელსაც შეუძლია კონკურენცია გაუწიოს წყალს. მაშინ

k 3 \u003d k 3 ' და P i (i \u003d 1, 2, 3) არის პროდუქტები.

v i = k კატა, i [S] / (K m + [S]) კატა, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) კატა, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) კატა, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

ვინაიდან ცნობილია, რომ K s / k 2 = K m / k კატა, და თუ ნუკლეოფილი არ არის, მაშინ

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

ხოლო მუდმივების დასადგენად შეგიძლიათ გამოიყენოთ წრფეების გადაკვეთის წერტილი კოორდინატებში 1/v N (და 1/v) - 1/[S]. ორი სწორი ხაზი ორმაგ შებრუნებულ კოორდინატებში იკვეთება მეორე კვადრატში. ნუკლეოფილის არარსებობის შემთხვევაში, ხაზის გადაკვეთის წერტილი ვერტიკალურ ღერძთან განისაზღვრება როგორც 1/V max და 1/k კატა, ხოლო ჰორიზონტალური ღერძით -1/Km. ორი წრფის გადაკვეთის წერტილის კოორდინატები: -1/K s და 1/k 3 . მანძილი 1/V max-სა და 1/k3-ს შორის არის 1/k2.

1.5 სრული რეაქციის კინეტიკური მრუდის ანალიზი

მიქაელის-მენტენის განტოლება თავდაპირველი სახით ეხება მხოლოდ შეუქცევად რეაქციებს, ე.ი. რეაქციებზე, სადაც გათვალისწინებულია მხოლოდ საწყისი სიჩქარე და საპირისპირო რეაქცია არ ჩნდება პროდუქტის არასაკმარისი რაოდენობის გამო და არ მოქმედებს რეაქციის სიჩქარეზე. შეუქცევადი რეაქციის შემთხვევაში, სრული კინეტიკური მრუდი შეიძლება ადვილად გაანალიზდეს (ნებისმიერი დროის ინტერვალით t ), მიქაელის-მენტენის ორიგინალური განტოლების ინტეგრირება. ამრიგად, ამ შემთხვევაში რჩება ვარაუდი, რომ რეაქციის დროს წარმოიქმნება მხოლოდ ერთი შუალედური ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსი. ვინაიდან დროის ინტერვალით თ არ არსებობს შეზღუდვები, სუბსტრატის კონცენტრაცია ანალიზის დროს არ შეიძლება იყოს თავდაპირველად შეყვანილი კონცენტრაციის ტოლი. ამრიგად, ასევე აუცილებელია გავითვალისწინოთ [S] ცვლილება რეაქციის მიმდინარეობისას. მოდით S 0 იყოს სუბსტრატის საწყისი კონცენტრაცია, (S 0 - y ) - კონცენტრაცია დროს t . შემდეგ, მიქაელის-მენტენის თავდაპირველი განტოლების საფუძველზე (თუ y არის გარდაქმნილი სუბსტრატის რაოდენობა), შეგვიძლია დავწეროთ

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

რეციპროკალების აღებით და ცვლადების გაყოფით, ჩვენ ვაერთიანებთ y-ზე 0-სა და y-ს შორის (V max მითითებულია როგორც ვ):

(2.303 / ტ) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

ამრიგად, განტოლების მარცხენა მხარის დამოკიდებულების გამოსახულებით y/t-ზე (ფოსტერ-ნიმანის კოორდინატები) , მიიღეთ სწორი ხაზი დახრილობით (-1/კმ) , ათვლის სეგმენტი y ღერძზე (V/K m) , ხოლო x ღერძზე - სეგმენტი V. ინტეგრალური განტოლება ასევე შეიძლება განსხვავებულად იყოს ხაზოვანი:

t / 2.3031 lg = y / 2.303 V lg + K m / V

ან t/y = 2,3031 Km lg / V y +1/V

თუ შექცევად რეაქციას ვსწავლობთ, აუცილებელია მივაქციოთ ყურადღება, რა დროის ინტერვალთან გვაქვს საქმე. ფერმენტის სუბსტრატთან შერევის მომენტში იწყება ე.წ. შექცევადი რეაქციების შესწავლისას საკმარისად დიდი დროის ინტერვალით, ეს ფაზა არ თამაშობს მნიშვნელოვან როლს, რადგან ამ ფაზაში რეაქცია არ მიმდინარეობს სრული სიჩქარით არც ერთი მიმართულებით.

მარცხნიდან მარჯვნივ მიმდინარე რეაქციისთვის, რეაქციაში ჩართული ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსები აღწევს სიჩქარის შემზღუდველ კონცენტრაციას მხოლოდ პრესტაციონარული ფაზის ბოლოს. კვაზი-სტაციონარული მდგომარეობა, რომელშიც სიჩქარის განმსაზღვრელი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსების კონცენტრაციები უახლოვდება კონცენტრაციების მაქსიმალურ მნიშვნელობებს სტაბილურ მდგომარეობაში, გრძელდება წამის რამდენიმე მეათედი ან წამი. ამ ფაზის განმავლობაში პროდუქტის წარმოქმნის (ან სუბსტრატის მოხმარების) სიჩქარე დროში თითქმის წრფივია. თეორიულად, პროდუქტის ფორმირება აქ ჯერ არ მომხდარა, მაგრამ პრაქტიკაში მისი კონცენტრაცია იმდენად დაბალია, რომ საპირისპირო რეაქციის სიჩქარე გავლენას არ ახდენს პირდაპირი რეაქციის სიჩქარეზე. ამ წრფივ ფაზას ეწოდება საწყისი რეაქციის სიჩქარე და ჯერჯერობით მხოლოდ ის გავითვალისწინეთ.

რეაქცია მარჯვნიდან მარცხნივ შემდეგ ეტაპზე ასევე დაჩქარებულია პროდუქტის კონცენტრაციის თანდათანობითი ზრდის გამო. (გარდამავალი მდგომარეობა;დროში აქამდე დაფიქსირებული წრფივობა ქრება). ეს ფაზა გრძელდება მანამ, სანამ რეაქციის სიჩქარე მარცხნიდან მარჯვნივ არ გახდება რეაქციის სიჩქარის ტოლი მარჯვნიდან მარცხნივ. ეს არის სახელმწიფო დინამიური ბალანსი,რადგან რეაქცია ორივე მიმართულებით ერთი და იგივე სიჩქარით გრძელდება.

2. ფაქტორები, რომლებზეც დამოკიდებულია ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე

.1 ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება ტემპერატურაზე

საშუალო ტემპერატურის მატებასთან ერთად, ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე იზრდება, მაქსიმუმს აღწევს ზოგიერთ ოპტიმალურ ტემპერატურაზე და შემდეგ ეცემა ნულამდე. ქიმიური რეაქციებისთვის, არსებობს წესი, რომ ტემპერატურის მატებასთან ერთად 10 ° C-ით, რეაქციის სიჩქარე იზრდება ორ-სამჯერ. ფერმენტული რეაქციებისთვის ეს ტემპერატურული კოეფიციენტი უფრო დაბალია: ყოველ 10°C-ზე რეაქციის სიჩქარე იზრდება 2-ით ან უფრო ნაკლებით. რეაქციის სიჩქარის შემდგომი შემცირება ნულამდე მიუთითებს ფერმენტის ბლოკის დენატურაციაზე. ფერმენტების უმეტესობისთვის ოპტიმალური ტემპერატურული მნიშვნელობები 20 - 40 0C დიაპაზონშია. ფერმენტების თერმომობილურობა დაკავშირებულია მათ ცილოვან სტრუქტურასთან. ზოგიერთი ფერმენტი უკვე დენატურირებულია დაახლოებით 40 0 ​​C ტემპერატურაზე, მაგრამ მათი უმეტესობა ინაქტივირებულია 40 - 50 0 C ზემოთ ტემპერატურაზე. ზოგიერთი ფერმენტი ინაქტივირებულია სიცივით, ე.ი. 0°C-თან ახლოს ტემპერატურაზე ხდება დენატურაცია.

სხეულის ტემპერატურის მატება (ცხელება) აჩქარებს ფერმენტების მიერ კატალიზებულ ბიოქიმიურ რეაქციებს. ადვილია გამოთვალოთ, რომ სხეულის ტემპერატურის ზრდა ყოველ გრადუსზე ზრდის რეაქციის სიჩქარეს დაახლოებით 20%-ით. მაღალ ტემპერატურაზე, დაახლოებით 39-40°C-ზე, საჭიროა დაავადებული ორგანიზმის უჯრედებში ენდოგენური სუბსტრატების უსარგებლო გამოყენება საკვებით მათი მიღების შესავსებად. გარდა ამისა, დაახლოებით 40°C ტემპერატურაზე შესაძლებელია ძალიან თერმოლაბილური ფერმენტების ნაწილის დენატურაცია, რაც არღვევს ბიოქიმიური პროცესების ბუნებრივ მიმდინარეობას.

დაბალი ტემპერატურა იწვევს ფერმენტების შექცევად ინაქტივაციას მისი სივრცითი სტრუქტურის უმნიშვნელო ცვლილების გამო, მაგრამ საკმარისია აქტიური ცენტრის და სუბსტრატის მოლეკულების შესაბამისი კონფიგურაციის ჩაშლას.

2.2 რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება გარემოს pH-ზე

ფერმენტების უმეტესობისთვის არსებობს გარკვეული pH მნიშვნელობა, რომლის დროსაც მათი აქტივობა მაქსიმალურია; ამ pH მნიშვნელობის ზემოთ და ქვემოთ, ამ ფერმენტების აქტივობა მცირდება. თუმცა, ყველა შემთხვევაში არ არის მრუდი, რომელიც აღწერს ფერმენტის აქტივობის დამოკიდებულებას pH-ზე ზარის ფორმის; ზოგჯერ ეს დამოკიდებულება შეიძლება პირდაპირ გამოხატული იყოს. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება pH-ზე ძირითადად მიუთითებს ფერმენტის აქტიური ცენტრის ფუნქციური ჯგუფების მდგომარეობაზე. გარემოს pH-ის ცვლილება გავლენას ახდენს აქტიური ცენტრის ამინომჟავების ნარჩენების მჟავე და ძირითადი ჯგუფების იონიზაციაზე, რომლებიც მონაწილეობენ ან სუბსტრატის შეკვრაში (კონტაქტურ ზონაში) ან მის ტრანსფორმაციაში (კატალიზურ არეში). მაშასადამე, pH-ის სპეციფიკური ეფექტი შეიძლება გამოწვეული იყოს ან ფერმენტისადმი სუბსტრატის აფინურობის ცვლილებით, ან ფერმენტის კატალიზური აქტივობის ცვლილებით, ან ორივე ერთად.

სუბსტრატების უმეტესობას აქვს მჟავე ან ძირითადი ჯგუფები, ამიტომ pH გავლენას ახდენს სუბსტრატის იონიზაციის ხარისხზე. ფერმენტი სასურველია უკავშირდებოდეს სუბსტრატის იონიზებულ ან არაიონიზებულ ფორმას. ცხადია, ოპტიმალური pH-ზე აქტიური ცენტრის ორივე ფუნქციური ჯგუფი ყველაზე რეაქტიულ მდგომარეობაშია და სუბსტრატი არის ისეთ ფორმაში, რომელიც სასურველია ფერმენტის ამ ჯგუფების მიერ შეკავშირებისთვის.

ფერმენტის აქტივობის pH-ზე დამოკიდებულების აღწერისას მრუდების აგებისას, pH-ის ყველა მნიშვნელობის გაზომვები ჩვეულებრივ ხორციელდება სუბსტრატით ფერმენტის გაჯერების პირობებში, რადგან ბევრი ფერმენტისთვის Km მნიშვნელობა იცვლება pH-ით.

ფერმენტის აქტივობის pH-ზე დამოკიდებულების დამახასიათებელი მრუდი შეიძლება ჰქონდეს განსაკუთრებით მარტივი ფორმა იმ შემთხვევებში, როდესაც ფერმენტი მოქმედებს ელექტროსტატიკურად ნეიტრალურ სუბსტრატებზე ან სუბსტრატებზე, რომლებშიც დამუხტული ჯგუფები არ თამაშობენ მნიშვნელოვან როლს კატალიზურ აქტში. ასეთი ფერმენტების მაგალითია პაპაინი, ისევე როგორც ინვერტაზა, რომელიც კატალიზებს ნეიტრალური საქაროზის მოლეკულების ჰიდროლიზს და ინარჩუნებს მუდმივ აქტივობას pH-ის დიაპაზონში 3,0-7,5.

pH მნიშვნელობა, რომელიც შეესაბამება ფერმენტის მაქსიმალურ აქტივობას, სულაც არ ემთხვევა ამ ფერმენტის ნორმალური უჯრედშიდა გარემოსთვის დამახასიათებელ pH მნიშვნელობას; ეს უკანასკნელი შეიძლება იყოს როგორც pH ოპტიმალურის ზემოთ და ქვემოთ. ეს ვარაუდობს, რომ pH-ის გავლენა ფერმენტის აქტივობაზე შეიძლება იყოს ერთ-ერთი ფაქტორი, რომელიც პასუხისმგებელია უჯრედში ფერმენტული აქტივობის რეგულირებაზე. ვინაიდან უჯრედი შეიცავს ასობით ფერმენტს და თითოეული მათგანი განსხვავებულად რეაგირებს pH-ის ცვლილებებზე, უჯრედის შიგნით pH მნიშვნელობა, შესაძლოა, ერთ-ერთი მნიშვნელოვანი ელემენტია უჯრედული მეტაბოლიზმის რეგულირების კომპლექსურ სისტემაში.

2.3 ფერმენტის ოდენობის განსაზღვრა მისი აქტივობით

) კატალიზებული რეაქციის მთლიანი სტექიომეტრია;

) კოფაქტორების შესაძლო საჭიროება - ლითონის იონებში ან კოენზიმებში;

) ფერმენტის აქტივობის დამოკიდებულება სუბსტრატისა და კოფაქტორის კონცენტრაციებზე, ე.ი. Km მნიშვნელობები როგორც სუბსტრატისთვის, ასევე კოფაქტორისთვის;

) pH მნიშვნელობა, რომელიც შეესაბამება ფერმენტის მაქსიმალურ აქტივობას;

) ტემპერატურის დიაპაზონი, რომლის დროსაც ფერმენტი სტაბილურია და ინარჩუნებს მაღალ აქტივობას.

გარდა ამისა, აუცილებელია თქვენს განკარგულებაში გქონდეთ საკმაოდ მარტივი ანალიტიკური ტექნიკა, რომელიც საშუალებას გაძლევთ განსაზღვროთ სუბსტრატის გაქრობის სიჩქარე ან რეაქციის პროდუქტების გარეგნობის სიჩქარე.

შეძლებისდაგვარად, ფერმენტის ანალიზი ტარდება სტანდარტულ პირობებში, რომელიც ინარჩუნებს ოპტიმალურ pH-ს და ინარჩუნებს სუბსტრატის კონცენტრაციას გაჯერების კონცენტრაციაზე ზემოთ; ამ შემთხვევაში, საწყისი სიჩქარე შეესაბამება რეაქციის ნულოვან წესრიგს სუბსტრატთან მიმართებაში და პროპორციულია მხოლოდ ფერმენტის კონცენტრაციასთან. ფერმენტებისთვის, რომლებიც საჭიროებენ კოფაქტორებს, ლითონის იონებს ან კოფერმენტებს, ამ კოფაქტორების კონცენტრაცია ასევე უნდა აღემატებოდეს გაჯერების კონცენტრაციას ისე, რომ ფერმენტის კონცენტრაცია იყოს სიჩქარის შემზღუდველი ფაქტორი. ზოგადად, რეაქციის პროდუქტის წარმოქმნის სიჩქარის გაზომვა შეიძლება შესრულდეს უფრო დიდი სიზუსტით, ვიდრე სუბსტრატის გაქრობის სიჩქარის გაზომვა, ვინაიდან სუბსტრატი ზოგადად უნდა იყოს შედარებით მაღალ კონცენტრაციებში ნულოვანი რიგის კინეტის შესანარჩუნებლად. რეაქციის პროდუქტის (ან პროდუქტების) წარმოქმნის სიჩქარე შეიძლება გაიზომოს ქიმიური ან სპექტრულ-ფოტომეტრიული მეთოდებით. მეორე მეთოდი უფრო მოსახერხებელია, რადგან ის საშუალებას გაძლევთ მუდმივად ჩაწეროთ რეაქციის მიმდინარეობა ჩამწერის ტკიპზე.

საერთაშორისო შეთანხმებით, ფერმენტული აქტივობის ერთეული არის ფერმენტის რაოდენობა, რომელსაც შეუძლია გამოიწვიოს სუბსტრატის ერთი მიკრომოლის გადაქცევა წუთში 25°C ტემპერატურაზე ოპტიმალურ პირობებში. კონკრეტული აქტივობაფერმენტი არის ფერმენტული აქტივობის ერთეულების რაოდენობა 1 მგ ცილაზე. ეს მნიშვნელობა გამოიყენება როგორც ფერმენტის პრეპარატის სისუფთავის კრიტერიუმი; ის იზრდება ფერმენტის გაწმენდისას და აღწევს მაქსიმალურ მნიშვნელობას იდეალურად სუფთა პრეპარატისთვის. ქვეშ რევოლუციების რაოდენობაგააცნობიეროს სუბსტრატის მოლეკულების რაოდენობა, რომლებიც განიცდიან ტრანსფორმაციას დროის ერთეულში ფერმენტის ერთ მოლეკულაზე (ან აქტიურ ცენტრში) იმ პირობებში, როდესაც რეაქციის სიჩქარე შეზღუდულია ფერმენტის კონცენტრაციით.

2.4 ფერმენტის გააქტიურება

ფერმენტების რეგულირება შეიძლება განხორციელდეს მათთან სხვადასხვა ბიოლოგიური კომპონენტის ან უცხო ნაერთების (მაგალითად, წამლებისა და შხამების) ურთიერთქმედებით, რომლებიც ჩვეულებრივ ე.წ. მოდიფიკატორებიან რეგულატორები ფერმენტები.ფერმენტზე მოდიფიკატორების გავლენით, რეაქცია შეიძლება დაჩქარდეს (აქტივატორები) ან შენელდეს. (ინჰიბიტორები).

ფერმენტების გააქტიურება განისაზღვრება ბიოქიმიური რეაქციების აჩქარებით, რომელიც ხდება მოდიფიკატორის მოქმედების შემდეგ. აქტივატორების ერთი ჯგუფი შედგება ნივთიერებებისგან, რომლებიც გავლენას ახდენენ ფერმენტის აქტიური ადგილის რეგიონზე. მათ შორისაა ფერმენტული კოფაქტორები და სუბსტრატები. კოფაქტორები (ლითონის იონები და კოენზიმები) არა მხოლოდ რთული ფერმენტების სავალდებულო სტრუქტურული ელემენტებია, არამედ არსებითად მათი აქტივატორებიც.

ლითონის იონები საკმაოდ სპეციფიკური აქტივატორებია. ხშირად, ზოგიერთ ფერმენტს სჭირდება არა ერთი, არამედ რამდენიმე ლითონის იონები. მაგალითად, Na +-სთვის, K + -ATPase, რომელიც ატარებს მონოვალენტურ კათიონებს უჯრედის მემბრანის მეშვეობით, მაგნიუმის, ნატრიუმის და კალიუმის იონები აუცილებელია როგორც აქტივატორები.

ლითონის იონების დახმარებით გააქტიურება სხვადასხვა მექანიზმით ხორციელდება. ზოგიერთ ფერმენტში ისინი კატალიზური ადგილის ნაწილია. ზოგიერთ შემთხვევაში, ლითონის იონები ხელს უწყობენ სუბსტრატის დაკავშირებას ფერმენტის აქტიურ ცენტრთან, ქმნიან ერთგვარ ხიდს. ხშირად, ლითონი ერწყმის არა ფერმენტს, არამედ სუბსტრატს, წარმოქმნის ლითონ-სუბსტრატის კომპლექსს, რომელიც სასურველია ფერმენტის მოქმედებისთვის.

სუბსტრატის შეკავშირებასა და კატალიზში კოენზიმების მონაწილეობის სპეციფიკა ხსნის მათ მიერ ფერმენტული რეაქციების გააქტიურებას. კოფაქტორების გამააქტიურებელი ეფექტი განსაკუთრებით შესამჩნევია ფერმენტზე მოქმედებისას, რომელიც არ არის გაჯერებული კოფაქტორებით.

სუბსტრატი ასევე არის აქტივატორი ცნობილი კონცენტრაციის ფარგლებში. სუბსტრატის გაჯერების კონცენტრაციის მიღწევის შემდეგ ფერმენტის აქტივობა არ იზრდება. სუბსტრატი ზრდის ფერმენტის სტაბილურობას და ხელს უწყობს ფერმენტის აქტიური ადგილის სასურველი კონფორმაციის ფორმირებას.

ლითონის იონები, კოენზიმები და მათი წინამორბედები და აქტიური ანალოგები,

სუბსტრატები შეიძლება გამოყენებულ იქნას პრაქტიკაში, როგორც პრეპარატები, რომლებიც ააქტიურებენ ფერმენტებს.

ზოგიერთი ფერმენტის გააქტიურება შეიძლება განხორციელდეს მოდიფიკაციით, რომელიც არ იმოქმედებს მათი მოლეკულების აქტიურ ცენტრზე. შესაძლებელია რამდენიმე მოდიფიკაცია:

1) არააქტიური წინამორბედის გააქტიურება - პროენზიმი,ან ზიმოგენი. მაგალითად, პეპსინოგენის პეპსინად გადაქცევა ;

2) აქტივაცია ფერმენტის მოლეკულაზე რაიმე სპეციფიკური მოდიფიკაციის ჯგუფის მიმაგრებით;

3) აქტივაცია არააქტიური კომპლექსის ცილის - აქტიური ფერმენტის დისოციაციის გზით.

2.5 ფერმენტის ინჰიბირება

არსებობს რეაგენტები, რომლებსაც შეუძლიათ მეტ-ნაკლებად კონკრეტულად ურთიერთქმედება ცილების ამა თუ იმ გვერდით ჯაჭვთან, რაც იწვევს ფერმენტის აქტივობის ინჰიბირებას. ეს ფენომენი შესაძლებელს ხდის ამ ფერმენტულ რეაქციაში ჩართული ამინომჟავების გვერდითი ნარჩენების ბუნების შესწავლას. თუმცა, პრაქტიკაში, გასათვალისწინებელია მრავალი დახვეწილობა, რაც ართულებს და ხშირად საეჭვოს ხდის კონკრეტული ინჰიბიტორებით მიღებული შედეგების ცალსახა ინტერპრეტაციას. უპირველეს ყოვლისა, იმისათვის, რომ ინჰიბიტორთან რეაქცია იყოს შესაფერისი რეაქციაში ჩართული გვერდითი ჯაჭვების ბუნების შესასწავლად, ის უნდა აკმაყოფილებდეს შემდეგ კრიტერიუმებს:

) იყოს კონკრეტული, ე.ი. ინჰიბიტორმა უნდა დაბლოკოს მხოლოდ სასურველი ჯგუფები;

) თრგუნავს ფერმენტის აქტივობას და ეს დათრგუნვა უნდა გახდეს სრული მოდიფიცირებული ჯგუფების რაოდენობის ზრდით;

) რეაგენტმა არ უნდა გამოიწვიოს ცილის არასპეციფიკური დენატურაცია.

არსებობს ინჰიბიტორების 2 ჯგუფი: შექცევადი და შეუქცევადი მოქმედება. დაყოფა ეფუძნება ფერმენტის აქტივობის აღდგენის კრიტერიუმს დიალიზის შემდეგ ან ფერმენტის ხსნარის ძლიერი განზავების ინჰიბიტორთან.

მოქმედების მექანიზმის მიხედვით განასხვავებენ კონკურენტულ, არაკონკურენტულ, არაკონკურენტულ, სუბსტრატულ და ალოსტერულ ინჰიბიციას.

კონკურენციის დათრგუნვა

კონკურენტული დათრგუნვა აღმოაჩინეს სუბსტრატის ანალოგებით გამოწვეული ინჰიბირების შესწავლისას. ეს არის ფერმენტული რეაქციის დათრგუნვა, რომელიც გამოწვეულია სუბსტრატის მსგავსი ინჰიბიტორის ფერმენტის აქტიურ ცენტრთან შეერთებით და ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნის თავიდან აცილებით. კონკურენტული ინჰიბიციის დროს, ინჰიბიტორი და სუბსტრატი, სტრუქტურით მსგავსი, კონკურენციას უწევს ფერმენტის აქტიურ ადგილს. მოლეკულების ნაერთი, რომელიც უფრო დიდია, უკავშირდება აქტიურ ცენტრს.

ასეთი იდეები ინჰიბირების მექანიზმის შესახებ დადასტურდა ექსპერიმენტებით კონკურენტული ინჰიბიციის რეაქციების კინეტიკაზე. ამრიგად, ნაჩვენებია, რომ კონკურენტული ინჰიბირების შემთხვევაში, სუბსტრატის ანალოგი არ ახდენს გავლენას უკვე წარმოქმნილი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დაშლის სიჩქარეზე; სუბსტრატის "უსასრულოდ დიდი" ჭარბი გამოყენებისას, იგივე მაქსიმალური მაჩვენებელი მიიღება როგორც ინჰიბიტორის არსებობისას, ასევე არარსებობის შემთხვევაში. პირიქით, ინჰიბიტორი გავლენას ახდენს დისოციაციის მუდმივისა და მიქაელის მუდმივის მნიშვნელობაზე. აქედან შეგვიძლია დავასკვნათ, რომ ინჰიბიტორი რეაგირებს ცილოვან ჯგუფებთან, რომლებიც ამა თუ იმ გზით მონაწილეობენ სუბსტრატის შეკვრაში, შესაბამისად, ამ ჯგუფებთან მისი ურთიერთქმედების გამო, სუბსტრატის შეკავშირების სიძლიერე მცირდება (ე.ი., ფერმენტის მოლეკულების რაოდენობა, რომლებსაც შეუძლიათ შეკავშირება. სუბსტრატი მცირდება).

მოგვიანებით აჩვენეს, რომ კინეტიკურად კონკურენტუნარიანი დათრგუნვა შეიძლება გამოწვეული იყოს არა მხოლოდ სუბსტრატის ანალოგებით, არამედ სხვა რეაგენტებითაც, რომელთა ქიმიური სტრუქტურა სრულიად განსხვავდება სუბსტრატისგან. ამ შემთხვევებში ასევე ვარაუდობდნენ, რომ ეს რეაგენტი ურთიერთქმედებს ჯგუფთან, რომელიც პასუხისმგებელია სუბსტრატის შეკვრაზე.

კონკურენტული დათრგუნვის თეორიულად ორი შესაძლებლობა არსებობს:

1) ფერმენტის დამაკავშირებელი და კატალიზური ადგილების გადახურვა; ინჰიბიტორი აკავშირებს მათ, მაგრამ გავლენას ახდენს მხოლოდ სავალდებულო ცენტრის ჯგუფებზე;

2) შემაკავშირებელი ცენტრი და კატალიზური ცენტრი ფერმენტის მოლეკულაში სივრცულად იზოლირებულია; ინჰიბიტორი ურთიერთქმედებს შემაკავშირებელ ადგილზე.

სადაც I არის ინჰიბიტორი, ხოლო K I არის ფერმენტ-ინჰიბიტორის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი.

ფარდობითი სიჩქარე (ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის თანაფარდობა გაზომილი ინჰიბიტორის თანდასწრებით (v i) , მაქსიმალურ სიჩქარემდე) უდრის

v i / V = ​​/ [E] T

ვინაიდან ფერმენტის მთლიანი კონცენტრაციისთვის ეს მართალია

[E]T = [E] + +

შემდეგ 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

ცხადია, თუ [I] = K I , მაშინ სწორი ხაზის დახრილობა ორჯერ უფრო დიდი ხდება, ვიდრე 1/v 0-ის [S]-ზე დამოკიდებულების შემთხვევაში (v 0 არის ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე ინჰიბიტორის არარსებობის შემთხვევაში).

დათრგუნვის ტიპი ჩვეულებრივ განისაზღვრება გრაფიკულად. კონკურენტული დათრგუნვა ყველაზე ადვილად აღიარებულია Lineweaver-Burk-ის ნაკვთების შედგენით (ანუ ნაკვეთები 1/v i-ში და 1/[S]) ინჰიბიტორის სხვადასხვა კონცენტრაციით. ნამდვილი კონკურენტული დათრგუნვით, მიიღება სწორი ხაზების ნაკრები, რომლებიც განსხვავდება დახრილობის კუთხის ტანგენსში და კვეთს y ღერძს (ღერძი 1/v i). ერთ მომენტში. ინჰიბიტორის ნებისმიერი კონცენტრაციისას შესაძლებელია სუბსტრატის ისეთი მაღალი კონცენტრაციის გამოყენება, რომ ფერმენტის აქტივობა იყოს მაქსიმალური.

კონკურენტული ინჰიბირების მაგალითია სხვადასხვა ნივთიერებების გავლენა სუქცინატდეჰიდროგენაზას აქტივობაზე. ეს ფერმენტი არის ფერმენტული ციკლური სისტემის ნაწილი - კრებსის ციკლი. მისი ბუნებრივი სუბსტრატი არის სუქცინატი, ხოლო მისი კონკურენტული ინჰიბიტორი არის ოქსალოაცეტატი, იგივე კრებსის ციკლის შუალედური პროდუქტი:

სუქცინატდეჰიდროგენაზას მსგავსი კონკურენტული ინჰიბიტორია მალონის მჟავა, რომელიც ხშირად გამოიყენება ბიოქიმიურ კვლევებში.

მრავალი ფარმაკოლოგიური პრეპარატის, სასოფლო-სამეურნეო მავნებლების განადგურების მიზნით გამოყენებული პესტიციდების და ქიმიური ომის აგენტების მოქმედება ეფუძნება კონკურენტული ინჰიბირების პრინციპს.

მაგალითად, ანტიქოლინესტერაზას პრეპარატების ჯგუფი, რომელიც მოიცავს მეოთხეული ამონიუმის ფუძეებისა და ფოსფორორგანული ნაერთების წარმოებულებს, წარმოადგენს ქოლინესტერაზას ფერმენტის კონკურენტულ ინჰიბიტორებს მის სუბსტრატს აცეტილქოლინთან მიმართებაში. ქოლინესტერაზა აკატალიზებს აცეტილქოლინის ჰიდროლიზს, ქოლინერგული სისტემების შუამავალი (ნეირომუსკულური სინაფსები, პარასიმპათიკური სისტემა და სხვ.). ანტიქოლინესთერაზას ნივთიერებები კონკურენციას უწევენ აცეტილქოლინს ფერმენტის აქტიური ადგილისთვის, უკავშირდებიან მას და აფერხებენ ფერმენტის კატალიზურ აქტივობას. ისეთი პრეპარატები, როგორიცაა პროზერინი, ფიზოსტიგმინი, სევინი, აფერხებენ ფერმენტს შექცევადად, ხოლო ფოსფორორგანული პრეპარატები, როგორიცაა არმინი, ნიბუფინი, ქლოროფოსი, სომანი მოქმედებენ შეუქცევადად, ფოსფორილირებენ ფერმენტის კატალიზურ ჯგუფს. მათი მოქმედების შედეგად აცეტილქოლინი გროვდება იმ სინაფსებში, სადაც ის ნერვული აგზნების შუამავალია, ე.ი. ორგანიზმი იწამლება დაგროვილი აცეტილქოლინით. შექცევადი ინჰიბიტორების მოქმედება თანდათან ქრება, ვინაიდან რაც უფრო მეტი აცეტილქოლინი გროვდება, მით უფრო სწრაფად ანაცვლებს ინჰიბიტორს ქოლინესტერაზას აქტიური ცენტრიდან. შეუქცევადი ინჰიბიტორების ტოქსიკურობა შეუდარებლად მაღალია, ამიტომ ისინი გამოიყენება სასოფლო-სამეურნეო მავნებლების, საყოფაცხოვრებო მწერების და მღრღნელების (მაგალითად, ქლოროფოს) წინააღმდეგ საბრძოლველად და ქიმიურ საომარ აგენტებად (მაგალითად, სარინი, სომანი და ა.შ.).

არაკონკურენტული დათრგუნვა

არაკონკურენტული ინჰიბიციისას სპეციფიკური ინჰიბიტორი არ ახდენს გავლენას ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის დისოციაციის მუდმივობაზე. მეორეს მხრივ, მაქსიმალური მიღწევადი რეაქციის სიჩქარე უფრო დაბალია ინჰიბიტორის არსებობისას, ვიდრე მისი არარსებობის შემთხვევაში, თუნდაც სუბსტრატის უსასრულოდ დიდი სიჭარბით. ინჰიბიციის არსებობა ადასტურებს, რომ ინჰიბიტორი აკავშირებს ცილას. დისოციაციის მუდმივის უცვლელობა ინჰიბიტორის არსებობისას და არარსებობისას, თავის მხრივ, მიუთითებს იმაზე, რომ სუბსტრატისგან განსხვავებით, ინჰიბიტორი აკავშირებს სხვა ჯგუფს. თეორიული თვალსაზრისით, ასეთი დათრგუნვის მექანიზმი შეიძლება სხვადასხვაგვარად იქნას განმარტებული.

ა) ფერმენტის შეკავშირების ადგილი და კატალიზური ადგილი განსხვავებულია. ამ შემთხვევაში კატალიზურ ცენტრთან დაკავშირებული ინჰიბიტორი ამცირებს ფერმენტის აქტივობას და მაქსიმალურ მიღწევას
სიჩქარე ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნაზე გავლენის გარეშე.

ბ) შებოჭვის ადგილი და კატალიზური ადგილი გადახურულია
ფერმენტის ზედაპირი და ინჰიბიტორი აკავშირებს ცილის სხვა ჯგუფებს. ინჰიბიტორის ფერმენტის ზედაპირთან შეკავშირების გამო ცილის ინფორმაცია იცვლება და ხდება არახელსაყრელი კატალიზის განსახორციელებლად.

გ) ინჰიბიტორი არ აკავშირებს არც კატალიზურ ადგილს და არც შეკავშირების ადგილს და, შესაბამისად, არ მოქმედებს ცილის კონფორმაციაზე. თუმცა, მას შეუძლია ადგილობრივად შეცვალოს მუხტის განაწილება ცილის ზედაპირის რეგიონში. აქტივობის დათრგუნვა ასევე შეიძლება მოხდეს ამ შემთხვევაში, თუ, მაგალითად, შეუძლებელი ხდება აქტივობის გამოვლინებისთვის აუცილებელი ჯგუფების იონიზაცია, ან თუ, პირიქით, ხდება ჯგუფების იონიზაცია მხოლოდ არაიონიზირებული ფორმით. ეს ფენომენი შეინიშნება ძირითადად ძლიერ მჟავე ან ძლიერ ტუტე რეაგენტების გამოყენებისას.

ინჰიბიტორი და სუბსტრატი არ ახდენენ გავლენას ფერმენტთან ერთმანეთთან შეკავშირებაზე, მაგრამ ინჰიბიტორის შემცველი ფერმენტული კომპლექსები სრულიად არააქტიურია. ამ შემთხვევაში, შეიძლება ვივარაუდოთ შემდეგი ელემენტარული ეტაპები:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

თუ [I] = K I, სწორი ხაზების ფერდობები და ვერტიკალურ ღერძთან გადაკვეთის წერტილის ორდინატები გაორმაგებულია 1/v 0-თან შედარებით.

არაკონკურენტული ინჰიბიტორებია, მაგალითად, ციანიდები, რომლებიც მჭიდრო კავშირშია რკინის რკინასთან, რომელიც ჰემინის ფერმენტის - ციტოქრომ ოქსიდაზას კატალიზური ადგილის ნაწილია. ამ ფერმენტის ბლოკადა თიშავს სასუნთქ ჯაჭვს და უჯრედი კვდება. არაკონკურენტული ფერმენტის ინჰიბიტორები მოიცავს მძიმე მეტალის იონებს და მათ ორგანულ ნაერთებს. ამიტომ, ვერცხლისწყლის, ტყვიის, კადმიუმის, დარიშხანის და სხვა მძიმე ლითონის იონები ძალიან ტოქსიკურია. ისინი ბლოკავენ, მაგალითად, SH- ჯგუფებს, რომლებიც შედის ფერმენტის კატალიზურ ადგილზე.

არაკონკურენტული ინჰიბიტორებია ციანიდები, რომლებიც მჭიდრო კავშირშია რკინის რკინასთან, რომელიც ჰემიური ფერმენტის - ციტოქრომ ოქსიდაზას კატალიზური ადგილის ნაწილია. ამ ფერმენტის ბლოკადა თიშავს სასუნთქ ჯაჭვს და უჯრედი კვდება. შეუძლებელია არაკონკურენტული ინჰიბიტორის მოქმედების მოცილება სუბსტრატის სიჭარბით (როგორც კონკურენტულის მოქმედებით), მაგრამ მხოლოდ იმ ნივთიერებებით, რომლებიც აკავშირებენ ინჰიბიტორს - რეაქტივატორებს.

არაკონკურენტული ინჰიბიტორები გამოიყენება როგორც ფარმაკოლოგიური აგენტები, ტოქსიკური ნივთიერებები მავნებლების კონტროლისთვის სოფლის მეურნეობაში და სამხედრო მიზნებისთვის. მედიცინაში გამოიყენება ვერცხლისწყლის, დარიშხანის, ბისმუტის შემცველი პრეპარატები, რომლებიც არაკონკურენტულად აფერხებენ ორგანიზმის უჯრედებში არსებულ ფერმენტებს ან პათოგენურ ბაქტერიებს, რაც განსაზღვრავს მათ ამა თუ იმ მოქმედებას. ინტოქსიკაციის შემთხვევაში შხამის შეკვრა ან მისი გადაადგილება ფერმენტ-ინჰიბიტორის კომპლექსიდან რეაქტივატორების დახმარებითაა შესაძლებელი. მათ შორისაა ყველა SH-ის შემცველი კომპლექსი (ცისტეინი, დიმერკაპტოპროპანოლი), ლიმონმჟავა, ეთილენდიამინტეტრაძმარმჟავა და ა.შ.

არაკონკურენტული დათრგუნვა

ამ ტიპის დათრგუნვას ლიტერატურაში ანტიკონკურენტულ ინჰიბიციასაც უწოდებენ. ან ასოცირებული ინჰიბირება , თუმცა, ტერმინი „არაკონკურენტული ინჰიბირება“ ყველაზე ფართოდ გამოიყენება. ამ ტიპის დათრგუნვის მახასიათებელია ის, რომ ინჰიბიტორს არ შეუძლია ფერმენტთან მიმაგრება, მაგრამ ის ერწყმის ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსს.

არაკონკურენტული ინჰიბიციის შემთხვევაში ინჰიბიტორის შემცველი კომპლექსი არააქტიურია:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

სუბსტრატის დათრგუნვა

სუბსტრატის დათრგუნვა არის ფერმენტული რეაქციის ინჰიბირება, რომელიც გამოწვეულია სუბსტრატის ჭარბი რაოდენობით. ასეთი დათრგუნვა ხდება ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნის გამო, რომელსაც არ ძალუძს გაიაროს კატალიზური ტრანსფორმაციები.ES 2 კომპლექსი არაპროდუქტიულია და ფერმენტის მოლეკულას არააქტიურს ხდის. სუბსტრატის დათრგუნვა გამოწვეულია სუბსტრატის სიჭარბით, შესაბამისად, იხსნება მისი კონცენტრაციის შემცირებისას.

ალოსტერიული ინჰიბიცია

ალოსტერული რეგულირება დამახასიათებელია მხოლოდ მეოთხეული სტრუქტურის მქონე ფერმენტების სპეციალური ჯგუფისთვის, რომლებსაც აქვთ ალოსტერული ეფექტორების შებოჭვის მარეგულირებელი ცენტრები. ნეგატიური ეფექტორები, რომლებიც აფერხებენ სუბსტრატის გარდაქმნას ფერმენტის აქტიურ ადგილას, მოქმედებს როგორც ალოსტერიული ინჰიბიტორები. პირიქით, დადებითი ალოსტერული ეფექტორები აჩქარებენ ფერმენტულ რეაქციას და ამიტომ მათ მოიხსენიებენ როგორც ალოსტერულ აქტივატორებს. ფერმენტების ალოსტერული ეფექტორები ყველაზე ხშირად სხვადასხვა მეტაბოლიტებია, ასევე ჰორმონები, ლითონის იონები და კოენზიმები. იშვიათ შემთხვევებში სუბსტრატის მოლეკულები ასრულებენ ფერმენტების ალოსტერული ეფექტორის როლს.

ფერმენტზე ალოსტერული ინჰიბიტორების მოქმედების მექანიზმი არის აქტიური ადგილის კონფორმაციის შეცვლა. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დაქვეითება ან Km-ის გაზრდის შედეგია ან V max მაქსიმალური სიჩქარის დაქვეითება იმავე გაჯერების სუბსტრატის კონცენტრაციებში, ე.ი. ფერმენტი ნაწილობრივ უმოქმედოა.

ალოსტერული ფერმენტები განსხვავდებიან სხვა ფერმენტებისგან მათი S- ფორმის რეაქციის სიჩქარის სპეციფიკური მრუდით სუბსტრატის კონცენტრაციასთან მიმართებაში. ეს მრუდი ჰგავს ჰემოგლობინის ჟანგბადით გაჯერების მრუდს, ეს მიუთითებს იმაზე, რომ ქვედანაყოფის აქტიური ცენტრები ფუნქციონირებენ არა ავტონომიურად, არამედ კოოპერატიულად, ე.ი. სუბსტრატისადმი ყოველი შემდეგი აქტიური ცენტრის მიდრეკილება განისაზღვრება წინა ცენტრების გაჯერების ხარისხით. ცენტრების კოორდინირებული მუშაობა განისაზღვრება ალოსტერული ეფექტორებით.

ალოსტერული რეგულირება ვლინდება ჯაჭვის პირველი ფერმენტის საბოლოო პროდუქტის მიერ ინჰიბირების სახით. საბოლოო პროდუქტის სტრუქტურა საწყისი ნივთიერების (სუბსტრატის) გარდაქმნების სერიის შემდეგ არ არის სუბსტრატის მსგავსი, ამიტომ საბოლოო პროდუქტს შეუძლია იმოქმედოს ჯაჭვის საწყის ფერმენტზე მხოლოდ როგორც ალოსტერიული ინჰიბიტორი (ეფექტორი). გარეგნულად, ასეთი რეგულირება უკუკავშირის მექანიზმით რეგულირების მსგავსია და საშუალებას გაძლევთ აკონტროლოთ საბოლოო პროდუქტის გამომუშავება, რომლის დაგროვების შემთხვევაში ჯაჭვში პირველი ფერმენტის მუშაობა ჩერდება. მაგალითად, ასპარტატ კარბამოილტრანსფერაზა (ACTase) კატალიზებს ექვსი რეაქციის პირველს ციტიდინ ტრიფოსფატის (CTP) სინთეზში. CTP არის ალოსტერული AKTase ინჰიბიტორი. ამიტომ, როდესაც CTP გროვდება, AKTase ინჰიბირება ხდება და შემდგომი CTP სინთეზი ჩერდება. აღმოჩენილია ფერმენტების ალოსტერული რეგულირება ჰორმონების დახმარებით. მაგალითად, ესტროგენები წარმოადგენენ ფერმენტ გლუტამატ დეჰიდროგენაზას ალოსტერულ ინჰიბიტორს, რომელიც კატალიზებს გლუტამინის მჟავას დეამინაციას.

ამრიგად, ფერმენტული რეაქციის უმარტივესი კინეტიკური განტოლებაც კი შეიცავს რამდენიმე კინეტიკურ პარამეტრს, რომელთაგან თითოეული დამოკიდებულია ტემპერატურასა და გარემოზე, რომელშიც მიმდინარეობს რეაქცია.

ინჰიბიტორები შესაძლებელს ხდის არა მხოლოდ ფერმენტული კატალიზის არსის გაგებას, არამედ არის ერთგვარი ინსტრუმენტი ინდივიდუალური ქიმიური რეაქციების როლის შესასწავლად, რომელიც შეიძლება კონკრეტულად გამორთოთ მოცემული ფერმენტის ინჰიბიტორის დახმარებით.

3. ზოგიერთი მოწყობილობა, რომელიც სასარგებლოა საწყისი რეაქციის სიჩქარის დასადგენად

ფერმენტული კინეტიკის მრავალი პრობლემა იწვევს საწყისი რეაქციის სიჩქარის განსაზღვრას (v 0). ამ მეთოდის მთავარი უპირატესობა ის არის, რომ დროის საწყის მომენტში განსაზღვრული v0-ის მნიშვნელობები იძლევა შესწავლილი ფერმენტების აქტივობის ყველაზე ზუსტ წარმოდგენას, ვინაიდან დაგროვებული რეაქციის პროდუქტებს ჯერ არ აქვთ დრო ინჰიბიტორული მოქმედებისთვის. ზემოქმედება ფერმენტზე და, გარდა ამისა, რეაქტიული სისტემა სტაციონარული წონასწორობის მდგომარეობაშია.

თუმცა, ლაბორატორიულ პრაქტიკაში, ასეთი რეაქციების პროგრესის ჩასაწერად ჩვეულებრივი სპექტროფოტომეტრიული, ტიტრიმეტრიული ან სხვა ტექნიკის გამოყენებისას, საუკეთესო შემთხვევაში, სუბსტრატში ფერმენტის შეყვანის საწყისი დროიდან 15-20 წამამდე, რეაქტიული სისტემის შერევით, დაკარგულია უჯრედის დაყენება და ა.შ. და ეს მიუღებელია, რადგან ამ შემთხვევაში ტანგენსი მიყვანილია იქამდე, რომ tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без მუდმივი შერევა კიდევ უფრო რთულდება რეაგენტების მოცულობითი კონცენტრაციების რყევებით.

ქვემოთ შემოთავაზებული მარტივი მოწყობილობები სპექტროფოტომეტრისთვის, pH მრიცხველისთვის და სხვა მსგავსი შესაძლებელს ხდის მნიშვნელოვნად შეამციროს მითითებული შეცდომების წყაროები v 0-ის განსაზღვრისას.

3.1 მოწყობილობა სპექტროფოტომეტრამდე

სპექტროფოტომეტრის მოწყობილობა შედგება დისპენსერი 1, მბრუნავი ტეფლონის ძაფი 2 (ამრევი) და დამაგრების თავსახური 3.

დისპენსერი არის მიკროპიპეტი, რომლის ერთი ბოლო ყალიბდება ნემსით 4, მეორე - გაფართოებით 5 (ფერმენტის რეზინის წვერში 6-ში შესვლის თავიდან ასაცილებლად).

ტეფლონის საფარს 3, რომელიც ფარავს სპექტრულ კუვეტას 7, აქვს ორი ხვრელი: ერთი (8) საფარის ცენტრში, მეორე (9) კუვეტის გაუმჭვირვალე კედელსა და 10 სინათლის სხივს შორის უფსკრულის შუაზე ზემოთ. ტეფლონი. მილი 11 (შიდა დიამეტრი 1 -1,5 მმ) ფიქსირდება მე-9 ხვრელში ერთ ბოლოზე, მეორე - ძრავის როტორის 13-ის წინ დამაგრებულ რაფაზე 12. ტეფლონის ძაფი 2 ჩასმულია მილის შიგნით (ძაფის სისქე 0,5-0,6 მმ. ). ძაფის ერთი ბოლო ფიქსირდება ძრავის 13 მბრუნავ როტორზე, მეორე - გადასული კუვეტაში 7 - ფორმირდება სპირალის სახით (შერევის გასაძლიერებლად). ძაფის პოზიცია განისაზღვრება ფიქსაციის თავსახურით 3, მიუხედავად ძრავის მანძილისა, რაც მოსახერხებელია მუშაობისას, რომელიც მოითხოვს კუვეტების ხშირი შეცვლას.

მოქმედების პრინციპი.სპექტროფოტომეტრი 7-ის კვარცის კუვეტი ივსება სუბსტრატით 14 (დაახლოებით 1,5-2,0 მლ), ჩასმულია სპექტროფოტომეტრის თერმოსტატული კუვეტის დამჭერში, დახურული სახურავით 3 მბრუნავი ტეფლონის ძაფით 2, რომელიც ჩაეფლო 14, სუბსტრაში. და ყველა შემდგომი ოპერაცია ხორციელდება უკვე სპექტროფოტომეტრის სინათლის სხივში და ჩაწერილია ჩამწერზე.

სამუშაოს დასაწყისში სუბსტრატი შერეულია და ჩამწერის კალამი წერს ბრტყელ ჰორიზონტალურ (ან „ნულოვან“) ხაზს. დისპენსერი (ფერმენტთან ერთად) შეჰყავთ მე-8 ხვრელში (ნემსი ჩაეფლო სუბსტრატის ხსნარში 14), წვერის 6-ის სწრაფი შეკუმშვით, ფერმენტი (ჩვეულებრივ დაახლოებით 0,03-0,05 მლ) შეჰყავთ სუბსტრატში და დისპენსერი. ამოღებულია. კომპონენტების შერევა მთავრდება 2,5-3 წმ-ში და ჩამწერის კალამი აფიქსირებს რეაქციის დასაწყისს ოპტიკური სიმკვრივის მრუდის (ΔA) დროის მიმართ გადახრით.

ასეთი მოწყობილობა შესაძლებელს ხდის ანალიზისთვის რეაქტიული სისტემიდან ნიმუშების აღებას; სისტემაში ინჰიბიტორების და აქტივატორების დამატება; რეაქციის პირობების შეცვლა (pH, იონური სიძლიერის შეცვლა და ა.შ.) რეაქციის კურსის რეგისტრაციის დარღვევის გარეშე, რაც ძალიან მოსახერხებელია, მაგალითად, გაყოფის შესწავლისას. ნ-NFF "მჟავე" ფოსფატაზები, სადაც ხდება გახლეჩა ნ-NFF ტარდება pH 5.0 (ან pH 6-7) და ფერმენტების აქტივობა განისაზღვრება დაგროვებით ნ-ნიტროფენოლატის იონები pH 9.5-10.0.

ასეთი მოწყობილობა ასევე მოსახერხებელია ფერმენტების სპექტროფოტომეტრიული ტიტრაციისთვის და ა.შ.

3.2 მოწყობილობა pH მრიცხველისთვის

pH მრიცხველის მოწყობილობა შედგება ნაკადის ელექტროდის 1-ის მოდიფიცირებული წვერისგან, ნახევრად მიკროცელი 2, დისპენსერი 3 და ელექტრონული წრედი pH მრიცხველის ჩამწერთან დასაკავშირებლად. გარდა ამისა, მოწყობილობაში შედის სტანდარტული pH მრიცხველის ელექტროდი (4), უჯრედის დამჭერის თავსახური (5), თერმოსტატული ნაკადის კამერა (6), სუბსტრატის ხსნარი (7), პასიური მაგნიტი (8) და აქტიური მაგნიტი ( 9).

pH მრიცხველის ნაკადის ელექტროდის სტანდარტული წვერი (LPU-01) იცვლება ტეფლონის მილით 1 (შიდა დიამეტრი 1,3-1,5 მმ), სავსე აზბესტის ძაფით, წინასწარ დამუშავებული გაჯერებული KCl ხსნარით. ძაფის შევსების სიმკვრივე კონტროლდება ისე, რომ KCl ხსნარის დინების სიჩქარე მილში ახლოს იყოს ორიგინალური უცვლელი ელექტროდის დინების სიჩქარესთან. წვერის ეს ჩანაცვლება შესაძლებელს ხდის ორიგინალური სამუშაო უჯრედის ზომის შემცირებას 20-25-დან 2 მლ-მდე, რაც შესაძლებელს ხდის ძვირადღირებული ბიოქიმიური პრეპარატების ხსნარების მინიმალური მოცულობით (1,5 მლ) მართვას.

pH მრიცხველის (LPU-01) ჩამწერთან დასაკავშირებლად ელექტრონული წრე შედგება დენის წყაროსგან (DC ბატარეა 12 V), მავთულის ცვლადი წინააღმდეგობა R 1 (10 - 100 Ohm), რომელიც ადგენს ძაბვას 9 ვ. D809 ზენერის დიოდი ვოლტმეტრის ჩვენების მიხედვით, მავთულის ცვლადი წინააღმდეგობა R 2 (15-150 Ohm), რომელიც არეგულირებს pH მრიცხველის "ნულოვანი" (საცნობარო წერტილი) დაყენებას ჩამწერის შკალაზე და ცვლადი მავთული. რეზისტენტობა R 3 (35-500 Ohm), რომელიც არეგულირებს ჩამწერზე pH-ის სკალის ჩვენებების გაფართოების (გაძლიერების) მასშტაბს. წრე საიმედოდ მუშაობს მანამ, სანამ წყაროს ძაბვა არ დაეცემა 9 ვ-ზე დაბლა.

მოქმედების პრინციპი. 1,5 მლ სუბსტრატი შეჰყავთ უჯრაში (მინის ცილინდრი 1,7x2,4 სმ), და უჯრედი ფიქსირდება სამაგრის თავსახურზე 5. ჩართულია 9 შერევა და ჩამწერის კალამი წერს ლუწი (ძირითადი) საცნობარო ხაზი. დისპენსერის დახმარებით 0,03 მლ ფერმენტის ხსნარი შეჰყავთ სუბსტრატში და ჩამწერის კალამი აფიქსირებს რეაქციის დასაწყისს pH-ის მრუდის გადახრით დროის (t) მიმართ.

ასეთი მოწყობილობა არ ცვლის pH სტატისტიკას, მაგრამ pH მრიცხველის მასშტაბის გაფართოების შესაძლებლობის გათვალისწინებით, საშუალებას გაძლევთ საიმედოდ ჩაიწეროთ მცირე ცვლილებები pH 0,004-0,005.

3.3 ნომოგრამის სახაზავები, მოსახერხებელი საწყისი სიჩქარის დასადგენად

ტანგენტების მეთოდით საწყისი სიჩქარის განსაზღვრის მნიშვნელოვან სირთულეს წარმოადგენს რეაგენტების კონცენტრაციების (Δ[S]) ცვლილებების კოეფიციენტების გამოთვლა ერთეულ დროში (Δt), ე.ი. გამოხატულება v 0 მ/წთ-ში იმ პირობებიდან, რომ

v 0 = lim Δ[S] / Δt, at, t 0.

პრაქტიკაში, ასეთი პროცედურა, როგორც წესი, შედგება სამი ან ოთხი ცალკეული მოქმედებისგან: ტანგენსი შედგენილია რეაქციის მრუდის საწყის მონაკვეთზე, შემდეგ რეგისტრირებული მნიშვნელობის ერთეულების რაოდენობა (ოპტიკური სიმკვრივე, ბრუნვის კუთხე და ა.შ.) გარკვეულზე. ითვლება დროის ინტერვალი და ეს იწვევს დროის ერთეულს და, ბოლოს, ხელახლა გამოთვალოს ჩამწერის ჩვენებები რეაგენტის კონცენტრაციის ცვლილებისთვის 1 წთ (მ/წთ). შემოთავაზებული ორი ტიპის ნომოგრამის სახაზავი შესაძლებელს ხდის ამ პროცედურის გამარტივებას.

მართკუთხა სახაზავი. v 0 არის Δ[S]/Δt შეფარდება, ე.ი. tg ά, სადაც ά არის ტანგენსის დახრის კუთხე t დროის ღერძზე. იგივე ტანგენტია აგრეთვე შესაბამისი მართკუთხა სამკუთხედის ჰიპოტენუზა ფეხებთან [S] და t. რაც უფრო დიდია v 0, მით უფრო ციცაბოა ტანგენსის დახრილობა. მაშასადამე, თუ თავს შევიზღუდავთ გარკვეული დროის ინტერვალით, მაგალითად, 1 წთ, მაშინ მივიღებთ მართკუთხა სამკუთხედების სერიას ფეხის სხვადასხვა მნიშვნელობით [S] (სინამდვილეში, v 0-ის სხვადასხვა მნიშვნელობებით. ). თუმცა, თუ ორივე ფეხი გრადუსირებულია: ჰორიზონტალური - დროის მითითების ერთეულებში (1 წთ) და ვერტიკალური - რეაგენტის კონცენტრაციის ცვლილების ერთეულებში, მაგალითად, მილიმოლებში (მმ) და მიღებული სეგმენტების გამოყენება შესაფერის ფორმატში. გამჭვირვალე მასალისგან (პლექსიგლასი დაახლოებით 2 მმ სისქისგან), მაშინ შეგიძლიათ მიიღოთ მოსახერხებელი სახაზავი საწყისი რეაქციის სიჩქარის დასადგენად. ყველა რიცხვი და სტრიქონი იბეჭდება მმართველის უკანა მხარეს, რათა აღმოიფხვრას პარალაქსის შეცდომები v 0-ის განსაზღვრისას.

v 0-ის განსაზღვრის პროცედურა ამ შემთხვევაში მცირდება ორ მარტივ ოპერაციამდე: ტანგენსი იხაზება კინეტიკური მრუდის საწყის მონაკვეთზე t. 2 და დააკავშიროთ სახაზავი t ჰორიზონტალური ფეხის ნულოვანი წერტილი ტანგენსის დასაწყისთან, ტანგენტის გაგრძელება ახლა გადაკვეთს კონცენტრაციის სკალას [S] იმ წერტილში, რომელიც განსაზღვრავს v 0-ის მნიშვნელობას M/წთ-ში (როდესაც ფეხი t ჰორიზონტალურია, დამატებითი ოპერაციები არ არის საჭირო.

რკალის ხაზი. v 0-ის განსაზღვრის პროცედურა შეიძლება გამარტივდეს ერთ ოპერაციამდე, თუ კონცენტრაციის მასშტაბი გამოსახულია გარკვეული რადიუსის რკალის გასწვრივ.

სწორი ("ძირითადი") ხაზი 2 გამოიყენება გამჭვირვალე მასალის ფირფიტაზე (ყველა რიცხვი და ხაზი ასევე გამოიყენება სახაზავის უკანა მხარეს) და ამ ხაზის ნულოვანი წერტილიდან (t=0, min) რადიუსი ფეხის სიგრძის ტოლი t=1 წთ [ , დავხატოთ რკალი [S], ზემოდან ქვემოდან, რომლის გასწვრივ განლაგებულია რეაგენტის კონცენტრაციის ცვლილებების მასშტაბი (მაგალითად, სუბსტრატი mM-ში).

სახაზავის აღწერილი ტიპები, მოწყობილობა სპექტროფოტომეტრისთვის და pH მრიცხველისთვის გამოიყენება მრავალი წლის განმავლობაში საწყისი რეაქციის სიჩქარის დასადგენად (v 0), ფერმენტების სუბსტრატის სპეციფიკის შესწავლისას, სპექტროფოტომეტრიული ტიტრირებისთვის და ა.შ.

დასკვნა

ამ ნაშრომში განხილული იყო ფერმენტოლოგიის განყოფილება, რომელიც შეისწავლის ფერმენტების მიერ კატალიზებული ქიმიური რეაქციების სიჩქარის დამოკიდებულებას გარემო ფაქტორებზე. ამ მეცნიერების ფუძემდებლებად მიჩნეულნი არიან მიქაელისი და მენტენი, რომლებმაც გამოაქვეყნეს ზოგადი მექანიზმის თეორია ფერმენტული რეაქციები, მიღებული განტოლება, რომელიც გახდა ფერმენტების ყველა კინეტიკური კვლევის ფუნდამენტური პრინციპი, იგი ემსახურება როგორც საწყისი წერტილი ფერმენტების მოქმედების ნებისმიერი რაოდენობრივი აღწერისთვის. ორიგინალური მიქაელის-მენტენის განტოლება არის ჰიპერბოლური განტოლება; ლაინვივერმა და ბურკმა წვლილი შეიტანეს კინეტიკაში მაიკლის-მენტენის განტოლების გარდაქმნით და სწორი ხაზის გრაფიკის მიღებით, საიდანაც ყველაზე ზუსტად შეიძლება განისაზღვროს V max-ის მნიშვნელობა.

დროთა განმავლობაში ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის ცვლილება ექსპერიმენტულ პირობებში ფერმენტულ რეაქციაში მცირდება. სიჩქარის დაქვეითება შეიძლება მოხდეს რიგი ფაქტორების გამო: სუბსტრატის კონცენტრაციის დაქვეითება, პროდუქტის კონცენტრაციის მატება, რომელსაც შეუძლია ჰქონდეს ინჰიბიტორული ეფექტი, ხსნარის pH-ის ცვლილება და ცვლილება. შეიძლება მოხდეს საშუალო ტემპერატურა. ამრიგად, ყოველი 10°C ტემპერატურის მატებაზე, რეაქციის სიჩქარე ორმაგდება ან კიდევ უფრო ნაკლები. დაბალი ტემპერატურა შექცევად ააქტიურებს ფერმენტებს. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება pH-ზე მიუთითებს ფერმენტის აქტიური ცენტრის ფუნქციური ჯგუფების მდგომარეობაზე. თითოეული ფერმენტი განსხვავებულად რეაგირებს pH-ის ცვლილებებზე. ქიმიური რეაქციების შეჩერება შესაძლებელია მათზე მოქმედებით სხვადასხვა სახის ინჰიბირებით. საწყისი რეაქციის სიჩქარე შეიძლება სწრაფად და ზუსტად განისაზღვროს ისეთი მოწყობილობების დახმარებით, როგორიცაა ნომოგრამის სახაზოები, სპექტროფოტომეტრიანი მოწყობილობა და pH მრიცხველი. ეს საშუალებას იძლევა შესწავლილი ფერმენტების აქტივობის ყველაზე ზუსტი წარმოდგენა.

ეს ყველაფერი დღეს აქტიურად გამოიყენება სამედიცინო პრაქტიკაში.

გამოყენებული წყაროების სია

1. ბელიასოვა ნ.ა. ბიოქიმია და მოლეკულური ბიოლოგია. - მინსკი: წიგნის სახლი, 2004. - 416გვ., ილ.

ქელეთი თ. ფერმენტული კინეტიკის საფუძვლები: პერ. ინგლისურიდან. - მ.: მირი, 1990. -350გვ., ილ.

3. კნორე დ.გ. ბიოლოგიური ქიმია: პროკ. ქიმიურისთვის, ბიოლ. და თაფლი. სპეციალისტი. უნივერსიტეტები. - მე-3 გამოცემა, რევ. - მ.: უმაღლესი. სკოლა 2002. - 479 გვ.: ავად.

4. კრუპიანენკო ვ.ი. ვექტორული მეთოდი ფერმენტული რეაქციების წარმოდგენისთვის. - მ.: ნაუკა, 1990. - 144გვ.

5. Lehninger A. ბიოქიმია. უჯრედის აგებულებისა და ფუნქციის მოლეკულური საფუძვლები: პერ. ინგლისურიდან. - მ.: მირი, 1974 წ.

6. სტროევი ე.ა. ბიოლოგიური ქიმია: სახელმძღვანელო ფარმაციისთვის. in-tov და pharmac. ყალბი. თაფლი. თანამებრძოლი. - მ.: უმაღლესი სასწავლებელი, 1986. - 479გვ., ილ.

სევერინ ე.ს. ბიოქიმია. ა. - მე-5 გამოცემა. - მ.: GEOTAR - მედია, 2009. - 786გვ., ილ.