Um estudo bacteriológico é um estudo destinado a isolar e estudar suas propriedades para fazer um diagnóstico microbiológico.

O material de teste deve ser retirado em condições assépticas em pratos estéreis e entregue ao laboratório o mais rápido possível. Se necessário, as amostras devem ser armazenadas refrigeradas. A técnica de amostragem depende do objeto, da natureza da doença e das propriedades do microrganismo. Um dos métodos mais comuns de pesquisa bacteriológica é a bacterioscopia.

Para estudar bactérias não fixadas, são utilizados dois métodos: gota esmagada (entre a lâmina e a lamínula) e. Deve ser lembrado que as preparações de bactérias não fixadas são contagiosas.

Esfregaços são usados ​​para bacterioscopia de preparações fixas. Para prepará-los, uma gota do líquido de teste é espalhada sobre a superfície de uma lâmina de vidro e depois seca. O método mais comum de fixação da droga é carregá-la através da chama de um bico de gás. Em alguns casos, são usados ​​compostos de fixação. As preparações fixas geralmente são coradas (consulte Coloração de Microrganismos). Entre os elementos mais importantes da pesquisa bacteriológica estão as culturas e subculturas produzidas por uma alça bacteriana ou uma pipeta de Pasteur. A alça é esterilizada por torrefação em chama, depois resfriada tocando uma área de ágar não inoculado ou enxaguando em líquido estéril. Ao usar uma pipeta Pasteur, sua ponta é quebrada com uma pinça, a pipeta é transportada várias vezes pela chama do queimador e deixada esfriar. Ao semear, são utilizados meios nutrientes líquidos e sólidos. Ao semear em ágar inclinado, a cultura de bactérias é esfregada com um laço sobre a superfície do ágar. Ao semear na espessura de uma coluna de ágar ou gelatina, o meio nutriente é perfurado no fundo do tubo de ensaio com um laço ou uma agulha especial. Ao semear em meio líquido, é necessário garantir que o líquido não derrame e não molhe as bordas dos tubos de ensaio e as rolhas. As inoculações e subculturas devem ser realizadas perto da chama de um bico de gás, os tubos de ensaio não devem permanecer abertos por muito tempo, a alça ou pipeta de Pasteur com a cultura não deve tocar em nada; antes de fechar o tubo, suas bordas devem ser queimadas. Os tubos inoculados devem ser rotulados imediatamente.

O passo mais importante na pesquisa bacteriológica é a identificação - determinação da espécie ou tipo de bactéria obtida na forma de cultura pura. Ao identificar bactérias, suas propriedades fisiológicas e bioquímicas, a formação de toxinas são estudadas. Métodos sorológicos para identificação de bactérias são amplamente utilizados (reações e). Em muitos casos, o método biológico de identificação de microrganismos é eficaz, baseado na infecção de animais de laboratório com o material de teste ou a cultura de bactérias resultante e a identificação de alterações patológicas características nos animais.

Métodos mecânicos e biológicos são usados ​​para isolar culturas puras. Um exemplo de método mecânico: uma gota do material de teste é esfregada com a mesma espátula estéril ou alça bacteriana sobre a superfície de um meio nutriente denso, sequencialmente no primeiro, segundo e terceiro. O isolamento de uma cultura pura é feito a partir de colônias individuais crescidas e consiste em seu estudo e triagem em meio nutriente fresco. Os métodos biológicos de isolamento de culturas puras baseiam-se em levar em conta uma ou outra propriedade do micróbio isolado, que o distingue de outros micróbios presentes no material em estudo.

No método biológico, é utilizado este tipo de meio nutriente, no qual são criadas condições favoráveis ​​ao desenvolvimento de um determinado tipo de micróbios. Os métodos biológicos também incluem a infecção de animais de laboratório sensíveis ao tipo isolado de bactéria.

A pesquisa bacteriológica é um conjunto de métodos para detecção de microrganismos patogênicos em um paciente, em um portador ou em objetos ambientais. Os estudos bacteriológicos também são utilizados para detectar micróbios condicionalmente patogênicos e sanitários-indicativos que caracterizam o grau de poluição do ambiente externo, para estudar a paisagem microbiana de um determinado ambiente (objeto). A pesquisa bacteriológica pode ser usada para o diagnóstico, prevenção de doenças infecciosas, para as características sanitárias e higiênicas do ambiente ao redor de uma pessoa, para pesquisa científica.

O material e o método da pesquisa bacteriológica dependem do objetivo da análise, das condições ambientais, da patogênese e do curso da doença. Na presença de bacteremia, o micróbio é detectado por hemocultura. Nos casos de lesões locais graves, o patógeno deve ser procurado na secreção ou secreções do órgão afetado (difteria, disenteria, gonorreia, etc.). Finalmente, nas doenças de evolução complexa, quando (como, por exemplo, na febre tifóide) a bacteremia é substituída por lesões do intestino delgado, é utilizado um método de pesquisa adequado em cada estágio: as hemoculturas são realizadas durante a primeira semana do doença, e o teste sorológico é mais confiável na segunda, a partir da terceira semana é obtido um resultado positivo na semeadura das fezes; este último método também é usado como estudo de controle para detectar portadores de bactérias entre convalescentes e monitorá-los.

A implementação de qualquer uma dessas tarefas é realizada por meio de métodos projetados para isolar e identificar microrganismos. Dependendo das características do micróbio, todo o complexo de métodos ou partes dele é usado.

A bacterioscopia é a técnica mais acessível baseada no exame microscópico do material. Quando microscopia de preparações frescas, pode-se usar algumas reações microquímicas (por exemplo, coloração de bactérias iodofílicas com solução de Lugol) ou coloração seletiva de várias partes estruturais das bactérias.

As bactérias podem ser identificadas mais claramente na preparação corada. O material de teste é aplicado a uma lâmina de vidro em uma camada fina e o mais uniforme possível. Deixe a preparação secar ao ar e fixe-a por um dos métodos geralmente aceitos, mas na maioria das vezes por chama, ou seja, duas ou três vezes rapidamente segurando a preparação sobre a chama do queimador para que o vidro fique quente, mas não quente. A preparação, resfriada após a fixação, é corada com uma coloração simples ou diferencial (ver Coloração de microorganismos). Na microscopia fluorescente, são usadas preparações nativas e secas. Nesse caso, o tratamento com certos corantes faz com que as estruturas do corpo microbiano ou o micróbio inteiro brilhem em raios ultravioleta ou azuis curtos. Em outra modificação, os micróbios são tratados com soros específicos marcados com fluorescentes (corantes). As bactérias correspondentes ao soro brilharão à medida que o soro marcado for depositado sobre elas. As bactérias heterólogas não brilham.

O método da bacterioscopia é amplamente utilizado para o diagnóstico bacteriológico de certas doenças infecciosas (gonorreia, tuberculose, febre recorrente), bem como no estudo de todo o complexo da microflora de um órgão (amígdalas, vagina), produto ou outro objeto.

O método de semeadura, ou seja, o isolamento de uma cultura pura do microrganismo desejado, é um método de diagnóstico bacteriológico mais preciso e confiável do que a bacterioscopia. O material fresco é espalhado sobre a superfície de um meio nutriente denso derramado em placas de Petri. A inoculação primária é realizada em meios convencionais favoráveis ​​a um determinado micróbio, em meios diferenciais ou seletivos. A escolha do meio nutriente (ver), bem como o método de pré-tratamento do material fresco para semeadura, depende do grau de sua contaminação com microflora estranha concomitante. Após 24-48 horas. conteúdo em um termostato na temperatura ideal para um determinado micróbio, as placas são examinadas e colônias suspeitas são subcultivadas em meios que promovem a reprodução desse patógeno. Assim, obtém-se uma cultura de bactérias homogêneas, que devem ser identificadas.

A identificação de um micróbio começa estudando da sua morfologia na preparação pintada e em uma baixa esmagada (ver) para a definição de uma forma de micróbios e a sua mobilidade. O próximo passo é estudar a capacidade enzimática das bactérias de quebrar carboidratos, aminoácidos e uréia em combinações específicas para cada espécie. As bactérias têm os açúcares e enzimas proteolíticas mais estudados.

A identificação de um micróbio deve ser complementada pelo estudo de outras propriedades características de cada gênero e espécie de microrganismos. Essas propriedades incluem a capacidade de dissolver seletivamente eritrócitos de diferentes animais (hemólise), coagular o plasma sanguíneo (coagulação plasmática), dissolver um coágulo de fibrina (fibrinólise), etc. Todas essas características das bactérias podem ser usadas em sua identificação como sinais diferenciais.

A identificação final de micróbios de algumas espécies, principalmente bactérias patogênicas da família intestinal, inclui a identificação sorológica (ver Identificação Microbiana). Normalmente, uma reação de aglutinação é definida para isso, ou seja, o acúmulo de bactérias é detectado sob a influência do soro imunológico de mesmo nome. A aglutinação de micróbios no soro contra uma determinada espécie indica pertencer a essa espécie. Normalmente, a reação de aglutinação é colocada aproximadamente em vidro e para a determinação final em tubos de ensaio com diluições de soro.

Um número de micróbios não pode ser totalmente determinado da maneira descrita. Então a identificação deve ser complementada pela infecção de animais de laboratório, pois algumas bactérias são caracterizadas por patogenicidade ou toxigenicidade, que se revela quando os animais são infectados. Em alguns casos, a infecção de animais também serve como método de acúmulo de micróbios patogênicos.

Somente uma comparação de todas as características de uma cultura, coletadas durante o estudo da morfologia, bioquímica, sorologia e, quando necessário, suas propriedades biológicas, pode fornecer base para a identificação. A resposta com um resultado positivo do estudo não é difícil se o micróbio isolado for típico. Neste caso, são indicados o gênero, a espécie e, se determinado, o tipo de bactéria. Ao isolar um micróbio que se desvia em algumas propriedades de uma característica típica, é dada uma resposta indicando a característica desviante. Nesse caso, é útil repetir o estudo se o curso da doença ou as condições de coleta do material permitirem. Também é útil submeter a cultura de micróbios atípicos a estudos adicionais por outros métodos mais complexos.

Os resultados negativos de um estudo bacteriológico são de relativa importância e mostram apenas que a porção estudada do material não continha os micróbios desejados ou não era viável. No entanto, eles podem estar presentes em uma porção diferente. Portanto, por exemplo, ao examinar portadores de bacilos (febre tifoide, disenteria, difteria), são necessários estudos repetidos.

Este é o principal método utilizado no diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas. A essência do método de pesquisa bacteriológica é a semeadura de material patológico de pacientes e o isolamento de uma cultura pura do patógeno, seguido de sua identificação por características morfológicas, culturais, tintológicas, bioquímicas e antigênicas.

O método de isolamento de culturas puras, que permite isolar certos tipos de micróbios de um ou outro habitat natural, é o método mais importante de pesquisa microbiológica. O primeiro a propor um método para isolar uma cultura pura foi L. Pasteur.

O método de Pasteur, baseado no uso de meios nutrientes líquidos, garantiu o isolamento de uma cultura pura principalmente de um material contendo um tipo de micróbio (por exemplo, de sangue em septicemia, etc.). Foi menos eficaz nos casos em que foi necessário isolar certos tipos de microrganismos da sua mistura. Enquanto isso, em condições naturais, o material para exame bacteriológico (escarro, pus, solo, água, etc.) geralmente contém uma mistura de vários microrganismos.

O isolamento bem-sucedido de misturas bacterianas e o estudo isolado de espécies individuais tornaram-se possíveis devido ao aprimoramento do método de isolamento de culturas puras por Robert Koch (R. Koch), que utilizou para esse fim em 1881 meio nutriente sólido em que durante a semeadura é possível distribuir o material de tal forma que as células microbianas individuais sejam isoladas umas das outras. Sob condições apropriadas (meio nutriente, temperatura ótima), a reprodução de células isoladas dá descendentes da mesma espécie, ou seja, uma cultura pura de uma dada espécie microbiana.

Após um certo período (na maioria das vezes em um dia), nos locais de um meio nutritivo denso em que as células isoladas estão localizadas, são formadas populações de micróbios multiplicados - os chamados colônia, visível a olho nu. Eles não representam um acúmulo caótico de micróbios, o que já pode ser julgado pelo fato de que para muitos tipos de micróbios as colônias têm uma estrutura característica, devido à qual é possível determinar aproximadamente a flora do material em estudo e selecionar aqueles colônias que estão sujeitas a um estudo mais aprofundado. Replantar essas colônias em um meio nutriente apropriado é o isolamento de uma cultura pura.

O isolamento de culturas puras com sua posterior identificação é de suma importância no diagnóstico de doenças infecciosas, garantindo seu rápido reconhecimento, tratamento oportuno e prevenção. Não é menos importante na determinação da microflora no estudo do estado sanitário e higiênico dos objetos ambientais (ar, água, solo etc.), bem como na pesquisa científica.

Numerosos métodos para isolar culturas puras estão agora disponíveis. Alguns deles são usados ​​de forma limitada, outros são amplamente utilizados. Os mais universais são os métodos descritos abaixo para isolar culturas bacterianas puras (método de Drigalsky). Enquanto outros microrganismos - espiroquetas, protozoários - requerem o uso de métodos especiais de isolamento ou não podem ser isolados em meios nutrientes artificiais (alguns protozoários, riquétsias, vírus).

Os métodos para isolar culturas puras de misturas microbianas são geralmente divididos em dois grupos principais: métodos baseados no princípio da separação mecânica de micróbios em um meio nutriente e métodos baseados no uso das propriedades biológicas dos micróbios. O primeiro grupo inclui métodos para isolar células individuais: 1) na profundidade do meio nutriente; 2) na superfície do meio e 3) sob o controle do olho. O segundo grupo usa propriedades dos micróbios como sua mobilidade, atitude em relação à temperatura, oxigênio e suas propriedades patogênicas.

Técnica de semeadura e replantio

semeando na prática microbiológica, chama-se introdução de algum material de teste em um meio nutriente estéril para detectar microrganismos.

Resemeaduraé a transferência de microrganismos cultivados para um ambiente estéril. Culturas e subculturas de micróbios são um dos métodos mais comuns na prática microbiológica.

As ressemeaduras são realizadas de forma que os microrganismos estranhos não entrem no meio nutritivo do ar ou da superfície dos objetos circundantes. Para isso, os seguintes passos devem ser rigorosamente observados:

1) as colheitas são feitas diretamente perto de um queimador aceso, em cuja chama são esterilizados laços, pinças, tampões de algodão, bordas de tubos de ensaio;

2) um tubo de ensaio com a cultura a ser cruzada é retirado na mão esquerda, o outro (com meio nutriente estéril) é mantido em posição inclinada entre o polegar e o indicador;

3) a alça é mantida na posição vertical sobre a chama do queimador e sua parte metálica é calcinada em brasa, e depois inclinada horizontalmente e o suporte da alça é esterilizado;

4) retire os tampões de algodão e segure-os com o dedo anelar e o dedo mínimo da mão direita; não é recomendado colocar rolhas na mesa ou em qualquer objeto;

5) queimar as bordas de ambos os tubos;

6) introduzir uma alça no tubo de ensaio com a cultura a ser subcultivada cuidadosamente, sem tocar nas paredes, capturar uma gota de líquido ou uma pequena quantidade de placa no meio sólido e transferir, tentando não tocar nas paredes, para o segundo tubo de ensaio com meio nutriente empobrecido;

7) o laço é retirado, as bordas dos tubos de ensaio e as extremidades internas das rolhas são queimadas. Se o tampão de algodão pegar fogo, feche o tubo de ensaio com ele e apague a extremidade externa com a mão ou uma pinça;

8) o laço é novamente disparado em chama, uma inscrição apropriada é feita no tubo de ensaio: o nome da cultura e a data da semeadura.

Semear em meio líquido pode ser produzido com uma pipeta Pasteur ou graduada. Ao usar uma pipeta Pasteur, use a pinça queimada para quebrar a extremidade selada e queime levemente a pipeta inteira. O tubo de ensaio com a cultura em estudo é colocado na mão esquerda e a pipeta é colocada na mão direita entre os dedos polegar e médio, segurando sua abertura superior com o dedo indicador.

Depois de retirar o algodão do tubo de ensaio, queime as bordas deste último. Abaixe cuidadosamente a pipeta no tubo de ensaio e remova o dedo indicador. Em seguida, feche a abertura superior da pipeta com o dedo indicador, retire-a do tubo de ensaio. O tampão de algodão e as bordas do tubo de ensaio são queimados antes de serem fechados. O material de teste é transferido para um meio líquido. Após a inoculação, as pipetas são colocadas em uma solução desinfetante.

Semeadura em mídia sólida. Ao semear em ágar oblíquo, é aplicado um golpe reto ou em ziguezague. Para isso, a alça com o material inoculado é introduzida no tubo de ensaio até que a água de condensação se acumule no fundo e, com cuidado, sem soltar o ágar, é aplicada uma pincelada. A inoculação sólida é obtida espalhando o inóculo sobre toda a superfície do ágar inclinado.

Em um meio denso em uma placa de Petri, a inoculação é realizada da seguinte forma. O meio nutriente em tubos de ensaio é derretido em banho-maria fervente, resfriado a 48-50°C e despejado em copos estéreis em uma camada uniforme de 3-5 mm de altura. O meio solidificado é seco em um termostato em copos fechados por 20-30 minutos. Copos abertos são colocados de cabeça para baixo nas prateleiras do termostato cobertos com papel estéril. As tampas são colocadas ao lado dos copos. Durante a secagem, a água de condensação evapora da superfície do meio nutriente e da superfície interna dos copos. A semeadura é feita com um laço na forma de traços paralelos ou com uma espátula de vidro.

Ao determinar o tipo de micróbio e para o cultivo de anaeróbios, eles produzem semeadura por injeção em uma coluna de ágar ou gelatina. Para fazer isso, o tubo de ensaio é virado de cabeça para baixo e uma coluna de meio é perfurada de cima para baixo até o fundo com uma agulha longa reta com inóculo. Em seguida, a agulha é cuidadosamente removida e o tubo de ensaio é fechado com um tampão de algodão queimado. Se forem necessárias precauções especiais contra a infecção, as colheitas são realizadas em um gabinete especial para replantar culturas puras. Os tubos inoculados e placas de Petri são colocados em uma incubadora de crescimento.

Microrganismos e esporos localizados dentro do meio nutriente ou em sua superfície não podem se mover, mas permanecem no local onde estavam no momento da solidificação. Cada célula ou esporo começa a se multiplicar e após 2-3 dias se forma colônia - um grande número de células do mesmo tipo. Se uma colônia foi formada a partir de uma única célula, será uma cultura pura do microrganismo de cuja célula cresceu.

As colônias em crescimento são vistas primeiro a olho nu e depois com uma lupa ou sob um microscópio. Ao mesmo tempo, é impossível não notar que as colônias diferem em aparência, cor, estrutura etc.

Método de pesquisa cultural (bacteriológico) - um conjunto de métodos destinados a isolar e identificar culturas puras de microrganismos (bactérias) por meio de cultura em meio nutriente.

Uma cultura pura é uma coleção de microrganismos da mesma espécie. Na maioria das vezes, uma cultura pura é obtida selecionando e cultivando uma colônia isolada (a descendência de uma única célula microbiana).

Etapas do método:

1. Coleta de material para pesquisa.

2. Isolamento de cultura pura e sua identificação.

3. Conclusão.

Coleta de material para pesquisa. O tipo de material estudado depende da finalidade do estudo (diagnóstico - do paciente; análise epidemiológica - do ambiente, alimentação, paciente e (ou) a bactéria portadora).

Isolamento de cultura pura. Inclui 3 ou 4 etapas:

1. Semear o material (após microscopia preliminar) em copo com meio nutriente denso (preferencialmente diagnóstico diferencial ou seletivo) para obter colônias isoladas. É produzido na maioria das vezes pelo método de separação mecânica. Em alguns casos (por exemplo, sangue), o material é pré-semeado em meio de enriquecimento líquido, seguido de subcultura em placa com meio de ágar. Às vezes, um tratamento seletivo do material é realizado antes da inoculação (levando em consideração as propriedades do microrganismo isolado; por exemplo, tratamento com ácido ou álcali para isolar bactérias resistentes). Cultivado a uma temperatura de 37°C por 18-24 horas. O tempo de cultivo para diferentes tipos de bactérias pode variar.

2(3): a) estudo de colônias em placa de ágar (características culturais), seleção das mais típicas; b) preparação de esfregaços dessas colônias com coloração (segundo Gram ou outros métodos); a) triagem do restante da colônia estudada no meio de acumulação e crescimento em termostato na temperatura ótima.

3(4). Estudo da pureza da cultura obtida no meio de acumulação. Com isso

o objetivo é preparar um esfregaço, manchar (geralmente de acordo com Gram), estudar microscopicamente

homogeneidade morfológica e tintorial (em diferentes campos de visão).

4(5). Identificação de cultura pura.

Conclusão. De acordo com a totalidade das características em comparação com as propriedades das cepas de referência (típicas), é indicado o tipo de microrganismo isolado do material.

Avaliação do método:

vantagens: sensibilidade e precisão relativamente altas, capacidade de determinar o número de micróbios no material de teste, bem como sensibilidade a antibióticos; limitações: duração relativa, o método é caro.

21. Meios nutrientes para aeróbios e anaeróbios. Requisitos para meios nutrientes, classificação.

Requisitos:

1. A mídia deve ser nutritiva

2. deve ter um certo ph

3. deve ser isotônico, ou seja. a pressão osmótica no meio deve ser a mesma que na célula.

4. deve ser úmido e não muito líquido

5. deve ter um certo potencial redox

6. deve ser estéril

7. deve ser unificado, ou seja, contêm quantidades constantes de ingredientes individuais.

Os meios nutrientes podem ser divididos:

A) Origem

1) natural - alimentos naturais (carne, leite, batata);

2) artificiais - especialmente preparados para o cultivo de micróbios: - meios de produtos naturais (água de carne, caldo de carne-peptona (MPB), ágar de carne-peptona (MPA), - não tendo uma composição constante; - meios nutrientes sintéticos - soluções de quantidades definidas de sais, aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas em água destilada - têm uma composição constante, são usadas para o crescimento de microrganismos e culturas celulares na produção de vacinas, soros imunológicos e antibióticos;

B) Por marcação:

1) uso geral (MPB, MPA) - a maioria dos micróbios cresce neles;

2) eletivo - promove seletivamente o crescimento de um tipo de micróbios a partir de uma mistura (por exemplo, ágar gema e sal para estafilococos);

TEMA: Esterilização, assepsia, antissepsia, desinfecção.

Princípios, métodos de cultivo de microrganismos e isolamento de culturas puras.

Método de pesquisa bacteriológica. Estágio 1.

1. Familiarize-se com os principais métodos de desinfecção e esterilização utilizados em microbiologia e medicina.

2. Conhecer as características do metabolismo dos microrganismos, os princípios do seu cultivo em laboratório.

3. Dominar a etapa 1 do método bacteriológico de diagnóstico de doenças infecciosas.

1. Métodos, dispositivos e modos de esterilização de meios nutrientes, vidraria de laboratório, instrumentos médicos.

2. Os principais grupos de desinfetantes, seu mecanismo de ação, área e método de aplicação.

3. Nomeação de meios nutrientes na prática microbiológica.

4. O princípio de obtenção de culturas puras de microrganismos e a essência do método bacteriológico, como "padrão ouro" no diagnóstico de doenças infecciosas.

5. Objetivo e sequência de realização da 1ª etapa do método bacteriológico de isolamento de culturas puras de microrganismos.

1. Selecione os meios, modo de esterilização e desinfecção de acordo com as tarefas específicas.

2. Descreva os meios nutrientes propostos usados ​​na prática microbiológica.

3. Realizar a 1ª etapa do método bacteriológico de isolamento de culturas puras de microrganismos aeróbios.

Perguntas do teste:

1. Efeito bacteriostático e bactericida de baixas e altas temperaturas sobre os microrganismos.

2. Efeito de produtos químicos de várias classes nos microrganismos. Antissépticos e desinfetantes.

3. Conceitos: esterilização, desinfecção, assepsia, antissepsia.

4. Métodos, equipamentos e modos de esterilização, cuja escolha depende das propriedades do objeto a ser esterilizado.

5. Os principais grupos de desinfetantes e as táticas de uso em estabelecimentos de saúde.

6. Princípios e métodos de cultivo de microrganismos.

7. Meios nutritivos: conceito; requisitos para eles; classificação.

8. O conceito de espécie, estirpe, colónia, cultura pura de microrganismos.

9. A essência do método bacteriológico e o alcance de sua aplicação.

10. Objetivo e sequência da 1ª etapa do método bacteriológico para o isolamento de aeróbios.

Tarefas realizadas durante a aula (UIRS):

1. Familiarize-se com os dispositivos utilizados para esterilização na prática médica e microbiológica: esterilizador a vapor (autoclave), forno Pasteur.

2. Selecione dispositivos e modos de esterilização de meios nutrientes, vidraria de laboratório, instrumentos médicos.

3. Familiarize-se com os desinfetantes utilizados na prática médica e microbiológica. Selecione desinfetantes e modo de desinfecção para os objetos propostos.

4. Familiarize-se com os vários meios nutrientes usados ​​na prática microbiológica, caracterize-os em termos de composição, consistência e finalidade.

5. Realize a etapa 1 do método bacteriológico para isolar culturas puras de aeróbios:

5.1. Preparar uma preparação fixa a partir do material de teste, corar por Gram, microscopicamente e identificar os microrganismos identificados pelas propriedades morfológicas e tintométricas.

5.2. Semeie o material de teste usando o método "traçado com uma plataforma".

5.3. Semear o material de teste usando o método Drygalski (demonstração).

6. Familiarize-se com o conjunto de ferramentas para coleta e transporte de materiais patológicos.

Diretrizes para a implementação da tarefa de pesquisa:

1. Conhecimento dos dispositivos utilizados para esterilização: esterilizador a vapor (autoclave), forno Pasteur.

1.1. Esterilizador a vapor (autoclave) - esterilização a vapor sob pressão.

O método de esterilização mais confiável e universal na prática médica e microbiológica é a esterilização a vapor sob pressão. É produzido em autoclave, na qual os objetos a serem esterilizados são aquecidos com vapor saturado a uma pressão acima da atmosférica. Entre as leituras do manômetro e a temperatura do vapor saturado existe a seguinte relação:

A pressão zero é considerada pressão atmosférica normal (760 mm Hg).

A esterilização só pode ser alcançada se a autoclave estiver totalmente operacional e operada adequadamente por pessoal especialmente treinado. Portanto, é necessário monitorar constantemente o regime de esterilização, que é realizado por métodos físicos (termômetro de máximo, etc.), biológicos (bioteste com esporos de culturas-teste de microrganismos) e químicos (testes químicos, indicadores como IS).

O controle do modo de esterilização das autoclaves é realizado por método químico a cada carregamento da autoclave. Teste químico - um tubo de vidro com uma substância química com um certo ponto de fusão: antipirina, resorcinol - 110 ± 1 °, ácido benzóico - 120 ± 2 °, benzamida - 126 ± 1 °, uréia, nicotinamida, D (+)-manose - 132 ±2°. Um corante de anilina (magenta, violeta genciana, etc.) é introduzido na composição dos testes químicos, que colore uniformemente a substância quando é derretida. Atualmente, os indicadores do tipo IS (Vinar, Rússia) são mais utilizados, representando uma tira de papel com uma camada de mistura de indicadores aplicada a ela e projetada para controle visual operacional não apenas da temperatura, mas também do tempo de esterilização (IS- 120, IS-132). O regime de esterilização é monitorado trimestralmente usando um bioensaio com esporos da cultura de teste Bacillus estearotermophilus BKM B-718.

1.2. Forno Pasteur - esterilização por calor seco.

No forno Pasteur são esterilizados produtos de vidro, metais e borrachas à base de borracha de silicone. Modo de esterilização: 160°C - 150 min; 180°C - 60 min. O controle do modo de esterilização em cada ciclo é realizado com a ajuda dos indicadores de esterilização IS-160, IS-180; trimestralmente - usando um bioteste com esporos de cultura de teste Bacillus licheniformis PCS. G BKM B-1711 D.

2. Preencha Casas tabela número 1.

Tabela 1.

Esterilização

3. Familiarize-se com desinfetantes e encha em aula tabela nº 2, usando os aplicativos nº 1, 2.

Mesa 2.

Desinfecção

4. Familiarize-se com o meio nutritivo e preencha em aula tabela nº 3 "Meios de nutrientes".

Tabela 3

5. A microbiologia clínica como ramo da microbiologia médica resolve duas tarefas principais: o diagnóstico etiológico de uma doença infecciosa e a escolha racional da terapia etiotrópica.

O principal método de diagnóstico microbiológico resolver esses problemas é método bacteriológico. A essência do método bacteriológico é isolar uma cultura pura do patógeno, determinar seu tipo e sensibilidade aos antimicrobianos.

Seleção do material em estudo depende do tipo de doença e da localização predominante do patógeno em um determinado estágio de seu desenvolvimento (patogênese). O material pode ser sangue, líquido cefalorraquidiano, secreção da ferida, escarro, fezes, urina, etc. A técnica de amostragem do material é de grande importância na obtenção de um resultado confiável.

O sucesso de isolar uma cultura pura é determinado pela exatidão escolha do meio nutritivo e condições de cultivo. Não existe um meio nutriente universal, cuja utilização permitirá isolar qualquer microrganismo de qualquer material de teste. Portanto, levando em consideração as características fisiológicas de possíveis patógenos, o material é semeado em um meio nutriente específico ou um complexo de meios nutrientes (especial, eletivo, diagnóstico diferencial). Alguns microrganismos também requerem condições especiais de cultivo (anaeróbicos, microaerofílicos, com alto teor de dióxido de carbono).

O material patológico de um paciente é muitas vezes uma mistura de microrganismos. Nesse sentido, a tarefa é separá-los e obtendo colônias isoladas. Uma colônia isolada, resultado da reprodução de uma célula microbiana e constituída por um tipo de célula, é a base para a obtenção de uma cultura pura. Na prática microbiológica, vários métodos são usados ​​para obter colônias isoladas. Os seguintes são mais comumente usados:

1. Semeando o material de teste método "stroke with pad"- o material de teste é aplicado na superfície de um meio nutriente denso em uma área limitada e depois distribuído por semeadura com movimentos paralelos freqüentes.

2. Método Drygalski- o material aplicado na primeira xícara com meio nutriente e semeado com espátula é inoculado sequencialmente com a mesma espátula, sem esterilizá-la, por mais 1-2 xícaras.

3. Método de cultivo do setor– o material estudado é semeado sequencialmente com um loop em vários setores. Ao mesmo tempo, uma certa técnica de semeadura (método ouro) permite não só obter colônias isoladas, mas também determinar o número de microrganismos em 1 ml (g) do material teste, o que é importante na avaliação do papel etiológico dos microrganismos oportunistas (OPM).

5.1. Realizando a 1ª etapa do método bacteriológico para o isolamento de aeróbios:

Preparar uma preparação fixa a partir do material de teste, corar de acordo com o método de Gram, microscopicamente, identificar os microrganismos detectados pelas propriedades morfotintoriais; preste atenção ao número de microorganismos. Registre os resultados no protocolo e tire uma conclusão;

Semeie o material de teste em meia xícara com um meio nutriente denso usando o método “batida com plataforma”;

· semear o material de teste em três placas com meio nutriente pelo método Drygalski (demonstração);

Rotule os pratos com a data da inoculação e coloque-os de cabeça para baixo em um termostato a 37°C por 18-24 horas.

6. Meios para coleta e entrega de material patológico

Nota: * - utilizado se o tempo de entrega do material ao laboratório após seu recebimento for superior a 1,5-2 horas.

Perguntas para autocontrole:

1. Nomeie e justifique os princípios de cultivo de microrganismos.

2. Por que são utilizados meios eletivos, diagnósticos diferenciais e de acúmulo para a semeadura de material patológico?

3. Justificar o princípio de obtenção de culturas puras de microrganismos.

4. Por que o método bacteriológico é o "padrão ouro" no diagnóstico microbiológico de doenças infecciosas?

5. Em que se baseiam os métodos químicos e biológicos para obtenção de culturas puras de microrganismos?

6. Qual é a diferença entre esterilização e desinfecção?

7. Justificar a finalidade da esterilização e desinfecção na prática microbiológica e médica.

8. Justifique a vantagem de usar sistemas de indicadores térmicos para monitorar o regime de esterilização (no exemplo de um indicador IS de Vinar, Rússia).

Literatura:

Tutoriais:

1. Borisov L. B. Microbiologia médica, virologia, imunologia. - M.: MIA LLC, 2002. - S. 26-29, 63-66, 150-159.

2. Pozdeev O. K. Microbiologia Médica / Ed. acad. RAMS V.I. Pokrovsky. - M.: GEOTAR Medicina, 2001. - S. 76-77, 126-130, 253-265.

Literatura adicional:

1. Segurança do trabalho com microrganismos dos grupos III - IV de patogenicidade e helmintos: Normas sanitárias. - M.: Centro Federal de Vigilância Sanitária e Epidemiológica do Ministério da Saúde da Rússia, 1999. - 107p.

Palestras sobre microbiologia.

Testes.

De acordo com os modernos programas da OMS, a base para a detecção da tuberculose no exterior é a microscopia de baciloscopias obtidas de pacientes com tosse que se candidataram a médicos de clínica geral; os esfregaços são corados de acordo com Ziehl-Neelsen. Esta técnica está incluída na policlínica doméstica e no exame clínico mínimo de um paciente que produz escarro. Em 1995, o Ministério da Saúde e Indústria Médica da Rússia, no pedido nº 8 "Sobre o desenvolvimento e melhoria das atividades de microbiologia clínica laboratorial (bacteriologia) de instituições médicas" confirmou esta obrigação dos laboratórios de diagnóstico clínico. O exame bacteriológico obrigatório do escarro para M. tuberculosis deve ser organizado para pacientes não transportáveis, pacientes com doenças crônicas dos órgãos respiratórios e do sistema urinário, bem como para trabalhadores de fazendas de gado desfavoráveis ​​à tuberculose. Este método mais antigo mantém totalmente sua importância devido à sua disponibilidade para laboratórios práticos de diagnóstico clínico, baixo custo e velocidade de implementação.

Quando a bacterioscopia de um esfregaço corado de acordo com Ziehl-Neelsen, o Mycobacterium tuberculosis pode ser detectado na presença de pelo menos 100.000 - 1.000.000 células bacterianas em 1 ml de material patológico (escarro). Um número tão grande de micobactérias ocorre em pacientes com formas progressivas avançadas da doença (disseminada e fibro-cavernosa). Em um número muito maior de pacientes, o número de micobactérias isoladas por eles está abaixo do limite do método bacterioscopia, o que é uma grande desvantagem desse método. Somente com o cumprimento perfeito de todas as condições exigidas especificadas na Ordem nº 109 do Ministério da Saúde da Federação Russa - o estudo de pelo menos três amostras de material de diagnóstico, a coleta correta de escarro, a disponibilidade de um microscópio binocular moderno e reagentes de alta qualidade, visualizando até 300 campos de visão - é possível aumentar a sensibilidade para 10.000 células microbianas.

As micobactérias da tuberculose têm a aparência de bastonetes finos, levemente curvados, de vários comprimentos com espessamentos nas extremidades ou no meio, dispostos em grupos e individualmente (Figura 1, a).

Microscopia fluorescente

O método é baseado na penetração de um derivado carbólico de um corante fluorescente (auramina, rodamina) em uma célula microbiana. Quando coradas com o corante fluorescente auramina-rodamina, as micobactérias podem ser vistas com ampliação de 100x sem imersão. O resultado é mais preciso quando corado por Ziehl-Neelsen com carbol fucsina e microscopia de imersão com aumento de 1000x. É a coloração de esfregaço de Ziehl-Nielsen que é recomendada ao usar tecnologias DOTS. As micobactérias neste caso parecem bastonetes amarelos luminosos (Figura 1, b). O método tem vantagens inegáveis, pois permite a visualização de praticamente todo o esfregaço com uma ampliação menor do microscópio, sendo também mais econômico, pois o tempo gasto na visualização dos esfregaços é reduzido.

As desvantagens do método LM incluem um custo significativamente maior de um microscópio luminescente, durante o procedimento de coloração, conformidade e correção do pH do esfregaço, bem como a liberação de micobactérias no material diagnóstico (especialmente no escarro) do muco circundante, o que impede a penetração do corante fluorescente na célula microbiana. Portanto, não é aconselhável o uso de ML para escarro nativo, mas é recomendado o uso desse método ao examinar esfregaços preparados após centrifugação a partir do sedimento do material processado para cultura e neutralizado após a descontaminação. Portanto, o método LM deve ser utilizado em laboratórios bacteriológicos, onde o exame cultural e microscópico podem ser realizados na mesma porção do material diagnóstico.

Durante o exame histológico ou citológico, às vezes é possível detectar células características da tuberculose, que são o resultado de uma reação protetora do organismo à introdução do bacilo da tuberculose. A presença de células gigantes de Langhans no citograma, sem dúvida, decide o diagnóstico de tuberculose. Estas células são muito grandes (80 - 90 mícrons ou mais de diâmetro). O citoplasma é corado em cinza-azulado. Ao longo de sua periferia, um grande número de núcleos (até 20) estão localizados em fila, dispostos em forma de anel (Figura 1, c).

Outro sinal da tuberculose é a presença na preparação das chamadas células epitelióides, das quais se desenvolvem as células de Langhans. Isso ocorre com o aumento do número de núcleos sem divisão do citoplasma, que só aumenta de tamanho (Figura 1, d).

A microscopia permite obter o resultado rapidamente, mas apresenta baixa sensibilidade e especificidade, impossibilitando a diferenciação de micobactérias ácido-resistentes.

Figura 1 - Mycobacterium tuberculosis
a - Método de coloração de Ziehl-Nelsen
b - método de microscopia de luminescência
c - Células de Langhas
d - células epitelióides

Método cultural

O método mais comum de detecção do Mycobacterium tuberculosis em nosso país é o método cultural. Este é o "padrão ouro" do diagnóstico bacteriológico da tuberculose, pois a sensibilidade do método é significativamente maior que a microscópica e possibilita a obtenção de uma cultura pura de micobactérias para sua posterior identificação e estudos de resistência a drogas. Este método dá resultados positivos na presença de 20 a 100 células microbianas viáveis ​​por 1 ml no material de teste. No entanto, é trabalhoso e demorado devido ao fato de o Mycobacterium tuberculosis crescer muito lentamente e sua detecção só pode ser registrada após 3 semanas de cultivo.

Historicamente, os meios de nutrientes à base de ovos (Levenshtein-Jensen, Finn-2, Ogawa, Anikin, Novaya, Popescu) são os meios de nutrientes sólidos mais amplamente utilizados para o isolamento de MBT. A inoculação do material no meio Levenstein-Jensen é realizada em um laboratório bacteriológico. O crescimento das primeiras colônias em meio clássico é observado após 4 a 8 semanas. No entanto, os meios de ágar Middlebrook (7H10, 7H11), que surgiram nos últimos anos, permitem a detecção mais rápida do crescimento de micobactérias (de duas a quatro semanas) e oferecem melhores oportunidades para estudar a morfologia das colônias do que em meios de ovos. A desvantagem do meio nutriente de ágar é a necessidade de incubar a semente em um termostato com dióxido de carbono, de modo que o meio de ágar praticamente não é usado na Rússia.

Deve-se notar que devido à alta seletividade de várias cepas de micobactérias e a necessidade de proteínas completas, ainda não existe um meio nutriente universal que possa substituir todos os outros. Na Ordem nº 109 do Ministério da Saúde da Federação Russa, recomenda-se usar um tubo de ensaio do meio nutriente internacional de Levenshtein-Jensen e Finn-2 para semear o material de diagnóstico no MBT. No entanto, a prática mostra que além desses meios, é aconselhável usar qualquer um dos adicionais, e a inoculação do meio nutriente em três tubos de ensaio também aumenta a eficiência do diagnóstico cultural.

Para um diagnóstico cultural completo da tuberculose, é necessário ter instalações e equipamentos adequados. Especialmente importante é a presença de uma proteção centrífuga e anti-aerossol e a capacidade de fornecer uma aceleração de 3000g. Bem como cabines de segurança biológica para prevenir infecção intralaboratorial.

A principal desvantagem do diagnóstico cultural da tuberculose é a duração do estudo - de três semanas a três meses. Portanto, mais pesquisas sobre o desenvolvimento de métodos para acelerar o crescimento de micobactérias permanecem relevantes.

Sistemas BACTEC

O diagnóstico cultural da tuberculose está atualmente passando por mudanças fundamentais associadas à introdução na prática de sistemas de cultivo MBT totalmente automatizados. A principal diferença entre esses métodos é o uso de meios nutrientes líquidos para cultivo seguido de detecção de crescimento radiométrico (BACTEC 460), colorimétrico (Mb-Bact, BactALERT) e luminescente (BACTEC MGIT 960). O crescimento de MBT em meio nutriente líquido nesses sistemas pode ser detectado após 1-2 semanas, dependendo de sua quantidade inicial no material de diagnóstico. A frequência de detecção de micobactérias também é um pouco maior do que em meios nutrientes densos. Sistemas BACTEC automatizados usando frascos apropriados contendo vários medicamentos anti-tuberculose podem reduzir o tempo para testar a resistência de micobactérias a medicamentos para 10-14 dias.

Dos sistemas automatizados listados, o sistema BACTEC MGIT 960BD é atualmente o mais eficaz. Os frascos MGIT com meio de cultura líquido 7H9 contêm um indicador fluorescente na parte inferior sob silicone, "extinguido" por altas concentrações de oxigênio. Na presença de crescimento de micobactérias no processo de absorção de oxigênio, o indicador começa a brilhar, o registro de fluorescência no sistema BACTEC MGIT é realizado automaticamente. O uso de frascos MGIT também é possível “manualmente”, então o registro da luminescência é realizado usando um transiluminador nos frascos MGIT por 11 dias.