Quase todas as reações bioquímicas são enzimáticas. Enzimas(biocatalisadores) são substâncias de natureza proteica ativadas por cátions metálicos. Cerca de 2.000 enzimas diferentes são conhecidas, e cerca de 150 delas foram isoladas, algumas das quais são usadas como drogas. A tripsina e a quimotripsina são usadas para tratar bronquite e pneumonia; pepsina - para o tratamento de gastrite; plasmina - para o tratamento de ataque cardíaco; pancreatina - para o tratamento do pâncreas. As enzimas diferem dos catalisadores convencionais em (a) maior atividade catalítica; (b) alta especificidade, i.e. ação seletiva.

O mecanismo de uma reação enzimática de substrato único pode ser representado pelo esquema:

onde E é uma enzima,

S - substrato,

ES - complexo enzima-substrato,

R é o produto da reação.

A característica do primeiro estágio da reação enzimática é Constante de Michaelis (K M). K M é o inverso da constante de equilíbrio:

a constante de Michaelis (KM) caracteriza a estabilidade do complexo enzima-substrato (ES). Quanto menor a constante de Michaelis (KM), mais estável é o complexo.

A velocidade de uma reação enzimática é igual à velocidade de sua etapa limitante de velocidade:

onde k 2 é a constante de velocidade, chamada número de revoluções ou atividade molecular da enzima.

atividade molecular de uma enzima(k 2) é igual ao número de moléculas de substrato que sofrem transformações sob a influência de uma molécula de enzima em 1 minuto a 25 0 C. Esta constante assume valores na faixa: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

Para a urease, que acelera a hidrólise da uréia, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; para a adenosina trifosfatase, que acelera a hidrólise do ATP, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; para catalase, que acelera a decomposição de H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.

No entanto, a equação cinética da reação enzimática na forma em que é dada acima é praticamente impossível de usar devido à impossibilidade de determinar experimentalmente a concentração do complexo enzima-substrato (). Expressando em termos de outras quantidades, facilmente determinadas experimentalmente, obtemos a equação cinética das reações enzimáticas, chamado Equação de Michaelis-Menten (1913):

,

onde o produto k 2 [E]tot é o valor da constante, que é denotada por (velocidade máxima).

Respectivamente:

Considere casos especiais da equação de Michaelis-Menten.

1) Em uma baixa concentração de substrato, K M >> [S], portanto

que corresponde à equação cinética da reação de primeira ordem.

2) Em uma alta concentração do substrato K m<< [S], поэтому

que corresponde à equação cinética da reação de ordem zero.

Assim, em uma baixa concentração de substrato, a taxa de reação enzimática aumenta com o aumento do conteúdo de substrato no sistema, e em uma alta concentração de substrato, a curva cinética atinge um platô (a taxa de reação não depende da concentração de substrato) ( Fig. 30).

Figura 30. - Curva cinética da reação enzimática

Se [S] = K M, então

que permite determinar graficamente a constante de Michaelis K m (Fig. 31).

Figura 31. - Definição gráfica da constante de Michaelis

A atividade enzimática é influenciada por: (a) temperatura, (b) acidez do meio, (c) presença de inibidores. A influência da temperatura na velocidade de uma reação enzimática é discutida no capítulo 9.3.

A influência da acidez do meio na velocidade da reação enzimática é mostrada na Figura 32. A atividade máxima da enzima corresponde ao valor ótimo do valor de pH (pH opt).

Figura 32. - Influência da acidez das soluções na atividade das enzimas

Para a maioria das enzimas, os valores de pH ideais coincidem com os valores fisiológicos (7,3 - 7,4). No entanto, existem enzimas que requerem um ambiente fortemente ácido (pepsina - 1,5-2,5) ou bastante alcalino (arginase - 9,5 - 9,9) para seu funcionamento normal.

Inibidores de enzimas- são substâncias que ocupam parte dos centros ativos das moléculas enzimáticas, pelo que a velocidade da reação enzimática diminui. Cátions de metais pesados, ácidos orgânicos e outros compostos atuam como inibidores.

Aula 11

A estrutura do átomo

Existem duas definições para o termo "átomo". Átomoé a menor partícula de um elemento químico que mantém suas propriedades químicas.

Átomoé um microssistema eletricamente neutro que consiste em um núcleo carregado positivamente e uma camada eletrônica carregada negativamente.

A doutrina do átomo percorreu um longo caminho de desenvolvimento. Os principais estágios no desenvolvimento da atomística incluem:

1) estágio natural-filosófico - o período de formação do conceito de estrutura atômica da matéria, não confirmado pela experiência (século V aC - século XVI dC);

2) o estágio de formação da hipótese sobre o átomo como a menor partícula de um elemento químico (séculos XVIII-XIX);

3) a etapa de criação de modelos físicos que refletem a complexidade da estrutura do átomo e permitem descrever suas propriedades (início do século XX)

4) o estágio moderno da atomística é chamado de mecânica quântica. Mecânica quânticaé um ramo da física que estuda o movimento das partículas elementares.

PLANO

11.1. A estrutura do núcleo. Isótopos.

11.2. Modelo quântico-mecânico da camada eletrônica do átomo.

11.3. Características físicas e químicas dos átomos.

A estrutura do núcleo. isótopos

núcleo do átomo- Esta é uma partícula carregada positivamente, consistindo de prótons, nêutrons e algumas outras partículas elementares.

É geralmente aceito que as principais partículas elementares do núcleo são prótons e nêutrons. Próton (p) -é uma partícula elementar cuja massa atômica relativa é 1 amu e cuja carga relativa é + 1. Nêutron (n) -é uma partícula elementar que não tem carga elétrica, cuja massa é igual à massa de um próton.

O núcleo contém 99,95% da massa de um átomo. Entre as partículas elementares, atuam forças nucleares especiais de extensão, superando significativamente as forças de repulsão eletrostática.

A característica fundamental de um átomo é carregar seu núcleos, igual ao número de prótons e coincidente com o número de série do elemento no sistema periódico de elementos químicos. Uma coleção (tipo) de átomos com a mesma carga nuclear é chamada Elemento químico. Elementos com números de 1 a 92 são encontrados na natureza.

isótopos- São átomos do mesmo elemento químico contendo o mesmo número de prótons e um número diferente de nêutrons no núcleo.

onde o número de massa (A) é a massa do núcleo, z é a carga do núcleo.

Cada elemento químico é uma mistura de isótopos. Como regra, o nome dos isótopos coincide com o nome de um elemento químico. No entanto, nomes especiais foram introduzidos para isótopos de hidrogênio. O elemento químico hidrogênio é representado por três isótopos:

Número p Número n

Prótio H 1 0

Deutério D 1 1

Trítio T 1 2

Os isótopos de um elemento químico podem ser estáveis ​​ou radioativos. Os isótopos radioativos contêm núcleos que colapsam espontaneamente com a liberação de partículas e energia. A estabilidade de um núcleo é determinada pela sua razão nêutron-próton.

Entrando no corpo, os radionuclídeos interrompem o curso dos processos bioquímicos mais importantes, reduzem a imunidade, condenam o corpo a doenças. O corpo se protege dos efeitos da radiação absorvendo seletivamente elementos do ambiente. Os isótopos estáveis ​​têm precedência sobre os isótopos radioativos. Em outras palavras, isótopos estáveis ​​bloqueiam o acúmulo de isótopos radioativos em organismos vivos (Tabela 8).

O livro de S. Shannon "Nutrition in the Atomic Age" fornece os seguintes dados. Se uma dose bloqueadora de um isótopo estável de iodo, igual a ~100 mg, for tomada no máximo 2 horas após a entrada do I-131 no corpo, a absorção de radioiodo na glândula tireoide diminuirá em 90%.

Os radioisótopos são usados ​​na medicina

para o diagnóstico de algumas doenças,

para o tratamento de todas as formas de câncer,

para estudos fisiopatológicos.

Tabela 8 - Efeito de bloqueio de isótopos estáveis

Cinética das reações enzimáticas. A cinética estuda as taxas, mecanismos de reações e a influência de fatores como concentração de enzimas e substratos, temperatura, pH do meio, presença de inibidores ou ativadores.

A uma concentração de substrato constante, a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima. O gráfico da dependência da velocidade da reação enzimática na concentração do substrato tem a forma de uma hipérbole isósceles.

Dependência da taxa de reação enzimática na concentração da enzima (a) e substrato (b)

A dependência da taxa de reação enzimática na concentração do substrato é descrita Equação de Michaelis-Menten:

onde V é a taxa estacionária da reação bioquímica; Vmax - velocidade máxima; Km - constante de Michaelis; [S] - concentração do substrato.

Se a concentração do substrato for baixa, ou seja, [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Então

Assim, em baixas concentrações de substrato, a taxa de reação é diretamente proporcional à concentração de substrato e é descrita por uma equação de primeira ordem. Isso corresponde à seção reta inicial da curva V = f[S] (figura b).

Em altas concentrações de substrato [S] >> Km, quando Km pode ser desprezado, a equação de Michaelis-Menten assume a forma, ou seja, V=Vmáx.

Assim, em altas concentrações de substrato, a taxa de reação torna-se máxima e é descrita por uma equação de ordem zero. Isso corresponde a uma seção da curva V =f [S], paralela ao eixo x.

Em concentrações de substrato numericamente comparáveis ​​à constante de Michaelis, a taxa de reação aumenta gradualmente. Isso é bastante consistente com as idéias sobre o mecanismo da reação enzimática:

onde S é o substrato; E - enzima; ES - complexo enzima-substrato; P - produto; k1 é a constante de velocidade para a formação do complexo enzima-substrato; k2 é a constante de velocidade da decomposição do complexo enzima-substrato com a formação dos reagentes iniciais; k3 é a constante de velocidade da decomposição do complexo enzima-substrato com a formação do produto.

Taxa de conversão de substrato com a formação do produto (P) é proporcional à concentração do complexo enzima-substrato. Em baixas concentrações de substrato, a solução contém um certo número de moléculas de enzimas livres (E) que não estão ligadas em um complexo (ES). Portanto, com o aumento da concentração do substrato, a concentração dos complexos aumenta e, consequentemente, a velocidade de formação do produto também aumenta. Em altas concentrações de substrato, todas as moléculas enzimáticas estão ligadas a um complexo ES (fenômeno de saturação enzimática), portanto, um aumento adicional na concentração de substrato praticamente não aumenta a concentração de complexos, e a taxa de formação do produto permanece constante.

Assim, fica claro o significado físico da velocidade máxima da reação enzimática. Vmax é a taxa na qual uma enzima reage, existindo inteiramente como um complexo enzima-substrato..

A constante de Michaelis corresponde numericamente a tal concentração de substrato na qual a velocidade estacionária é igual à metade do máximo. Esta constante caracteriza a constante de dissociação do complexo enzima-substrato:

O significado físico da constante de Michaelis na medida em que caracteriza a afinidade da enzima pelo substrato. Km tem valores pequenos quando k1 > (k2 + k3), ou seja, o processo de formação do complexo ES prevalece sobre os processos de dissociação do ES. Portanto, quanto menor o valor de Km, maior a afinidade da enzima pelo substrato. Por outro lado, se Km é grande, então (k2 + k3) > k1 e processos de dissociação ES predominam. Neste caso, a afinidade da enzima pelo substrato é baixa.

Inibidores e ativadores de enzimas . Inibidores de enzimas chamadas substâncias que reduzem a atividade das enzimas. Quaisquer agentes desnaturantes (por exemplo, sais de metais pesados, ácidos) são inibidores de enzimas não específicos.

Inibidores reversíveis são compostos que interagem de forma não covalente com uma enzima. inibidores irreversíveis- são compostos que se ligam especificamente aos grupos funcionais do centro ativo e formam ligações covalentes com a enzima.

A inibição reversível é dividida em competitiva e não competitiva. Inibição competitiva sugere similaridade estrutural entre inibidor e substrato. O inibidor ocupa um lugar no sítio ativo da enzima e um número significativo de moléculas de enzima é bloqueado. A inibição competitiva pode ser removida aumentando a concentração do substrato. Neste caso, o substrato desloca o inibidor competitivo do sítio ativo.

A inibição reversível pode ser não competitivo em relação ao substrato. Neste caso, o inibidor não compete pelo sítio de ligação com a enzima. O substrato e o inibidor ligam-se a sítios diferentes, então existe a possibilidade de formação do complexo IE, assim como o complexo ternário IES, que pode se decompor com a liberação do produto, mas em velocidade mais lenta que o complexo ES .

De a natureza de sua ação Os inibidores são divididos em:

• específico,
• não específico.

Inibidores específicos têm seu efeito sobre a enzima, unindo-se a uma ligação covalente no centro ativo da enzima e desligando-a da esfera de ação.

Inibição não específica envolve o efeito sobre a enzima de agentes desnaturantes (sais de metais pesados, ureia, etc.). Neste caso, como resultado da destruição da estrutura quaternária e terciária da proteína, a atividade biológica da enzima é perdida.

Ativadores de enzimas são substâncias que aumentam a velocidade de uma reação enzimática. Na maioria das vezes, os íons metálicos (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, etc.) atuam como ativadores. Distinguir entre os metais que fazem parte das metaloenzimas, que são cofatores e atuando como ativadores enzimáticos. Os cofatores podem se ligar fortemente à parte proteica da enzima, mas quanto aos ativadores, eles são facilmente separados da apoenzima. Tais metais são participantes obrigatórios do ato catalítico, que determina a atividade da enzima. Ativadores aumentar o efeito catalítico, mas sua ausência não impede que a reação enzimática prossiga. Como regra, o cofator metálico interage com os grupos carregados negativamente do substrato. Um metal com valência variável participa da troca de elétrons entre o substrato e a enzima. Além disso, estão envolvidos na formação de uma conformação transicional estável da enzima, o que contribui para uma formação mais rápida do complexo ES.

Regulação da atividade enzimática . Um dos principais mecanismos de regulação do metabolismo é a regulação da atividade enzimática. Um exemplo é a regulação alostérica, regulação por ativadores e inibidores. Muitas vezes, o produto final da via metabólica é um inibidor da enzima reguladora. Esse tipo de inibição é chamado retroinibição ou inibição por feedback negativo.

Muitas enzimas são produzidas como precursores de proenzimas inativos e então ativados no momento certo por proteólise parcial. Proteólise parcial- clivagem de uma parte da molécula, o que leva a uma mudança na estrutura terciária da proteína e à formação do centro ativo da enzima.

Algumas enzimas oligoméricas podem alterar sua atividade devido a associações - dissociações de subunidades incluídos em sua composição.

Muitas enzimas podem ser encontradas em duas formas: como uma proteína simples e como uma fosfoproteína. A transição de uma forma para outra é acompanhada por uma mudança na atividade catalítica.

A velocidade de uma reação enzimática depende quantidades de enzimas, que na célula é determinado pela razão das taxas de sua síntese e decaimento. Esta forma de regular a velocidade de uma reação enzimática é um processo mais lento do que a regulação da atividade enzimática.

A cinética enzimática estuda a velocidade das reações catalisadas por enzimas dependendo de várias condições (concentração, temperatura, pH, etc.) de sua interação com o substrato.

No entanto, as enzimas são proteínas sensíveis à influência de várias influências externas. Portanto, ao estudar a velocidade das reações enzimáticas, principalmente as concentrações dos reagentes são levadas em consideração, e a influência da temperatura, pH do meio, ativadores, inibidores e outros fatores tenta ser minimizada e condições padrão são criadas. Primeiro, este é o valor de pH ideal do meio para esta enzima. Em segundo lugar, recomenda-se manter a temperatura a 25°C, sempre que possível. Em terceiro lugar, a saturação completa da enzima com o substrato é alcançada. Este ponto é especialmente importante, uma vez que em uma baixa concentração de substrato, nem todas as moléculas de enzima participam da reação (Fig. 6.5, uma), o que significa que o resultado estará longe do máximo possível. O poder mais alto da reação catalisada, tudo o mais constante, é alcançado se cada molécula de enzima estiver envolvida na transformação, ou seja, em uma alta concentração do complexo enzima-substrato (Fig. 6.5, dentro). Se a concentração do substrato não garantir a saturação completa da enzima (Fig. 6.5, b), então a velocidade da reação não atinge o valor máximo.

Arroz. 65.

uma - em baixa concentração de substrato; 6 - com concentração insuficiente do substrato; dentro - quando a enzima está completamente saturada com o substrato

A taxa de uma reação enzimática, medida sob as condições acima, e a saturação completa da enzima com o substrato é chamada taxa máxima de reação enzimática (V).

A velocidade da reação enzimática, determinada quando a enzima não está completamente saturada com o substrato, é denotada v.

A catálise enzimática pode ser descrita de forma simplista pelo esquema

onde F é uma enzima; S - substrato; FS - complexo enzima-substrato.

Cada etapa deste processo é caracterizada por uma certa velocidade. A unidade para medir a velocidade de uma reação enzimática é o número de mols do substrato convertido em uma unidade de tempo(como a velocidade de uma reação normal).

A interação da enzima com o substrato leva à formação de um complexo enzima-substrato, mas esse processo é reversível. As velocidades das reações direta e inversa dependem das concentrações dos reagentes e são descritas pelas equações correspondentes:

A Equação (6.3) é válida em equilíbrio, pois as velocidades das reações direta e inversa são iguais.

Substituindo as taxas de reações diretas (6.1) e inversas (6.2) na equação (6.3), obtemos a igualdade:

O estado de equilíbrio é caracterizado pela correspondente constante de equilíbrio K p, igual à razão das constantes das reações diretas e inversas (6.5). O inverso da constante de equilíbrio é chamado constante de substrato K s , ou a constante de dissociação do complexo enzima-substrato:

A partir da equação (6.6) fica claro que a constante do substrato diminui a uma alta concentração do complexo enzima-substrato, i.e. com grande estabilidade. Portanto, a constante do substrato caracteriza a afinidade da enzima e o substrato e a razão das constantes de velocidade para a formação e dissociação do complexo enzima-substrato.

O fenômeno da saturação de uma enzima com um substrato foi estudado por Leonor Michaelis e Maud Mepten. Com base no processamento matemático dos resultados, eles derivaram a equação (6.7), que recebeu seus nomes, da qual fica claro que a uma alta concentração do substrato e um baixo valor da constante do substrato, a velocidade da reação enzimática tende a ao máximo. No entanto, esta equação é limitada porque não leva em consideração todos os parâmetros:

O complexo enzima-substrato durante a reação pode sofrer transformações em diferentes direções:

• dissociar nas substâncias originais;
• ser convertido em um produto do qual a enzima é separada inalterada.

Portanto, para descrever o efeito global do processo enzimático, o conceito Constantes de Michaelis K t, que expressa a relação das constantes de velocidade de todas as três reações de catálise enzimática (6.8). Se ambos os termos forem divididos pela constante de velocidade da reação de formação do complexo enzima-substrato, então a expressão (6.9) será obtida:

Um corolário importante segue da equação (6.9): a constante de Michaelis é sempre maior que a constante do substrato por k 2 /kv

Numericamente K té igual a tal concentração do substrato na qual a taxa de reação é metade da taxa máxima possível e corresponde a tal saturação da enzima com o substrato, como na Fig. 6.5, b. Como na prática nem sempre é possível atingir a saturação completa da enzima com o substrato, é K t usado para comparar as características cinéticas de enzimas.

A velocidade da reação enzimática no caso de saturação incompleta da enzima com o substrato (6.10) depende da concentração do complexo enzima-substrato. O coeficiente de proporcionalidade é a constante de reação para a liberação da enzima e do produto, pois isso altera a concentração do complexo enzima-substrato:

Após as transformações, levando-se em conta as dependências apresentadas acima, a velocidade da reação enzimática no caso de saturação incompleta da enzima com o substrato é descrita pela equação (6.11), ou seja. depende das concentrações da enzima, substrato e sua afinidade Ks:

A dependência gráfica da velocidade da reação enzimática na concentração do substrato não é linear. Como é óbvio da Fig. 6.6, com um aumento na concentração do substrato, observa-se um aumento na atividade da enzima. No entanto, quando a saturação máxima da enzima com o substrato é atingida, a velocidade da reação enzimática torna-se máxima. Portanto, o fator que limita a velocidade da reação é a formação de um complexo enzima-substrato.

A prática mostrou que as concentrações de substratos, via de regra, são expressas em valores muito menores que a unidade (10 6 -10 3 mol). É bastante difícil operar com tais quantidades nos cálculos. Portanto, G. Lineweaver e D. Burke propuseram expressar a dependência gráfica da velocidade da reação enzimática não em coordenadas diretas, mas em coordenadas inversas. Eles partiram da suposição de que para valores iguais, seus recíprocos também são iguais:

Arroz. 6.6.

Após a transformação da expressão (6.13), obtém-se uma expressão, denominada Equação Lineweaver-Burk (6.14):

A dependência gráfica da equação Lineweaver-Burk é linear (Fig. 6.7). As características cinéticas da enzima são determinadas da seguinte forma:

• o segmento cortado no eixo y é igual a 1/V;
• o segmento cortado no eixo x é -1 /Kt.

Arroz. 6.7.

Acredita-se que o método Lineweaver - Burke permite determinar com mais precisão a taxa máxima de reação do que em coordenadas diretas. Informações valiosas sobre a inibição enzimática também podem ser extraídas deste gráfico.

Existem outras maneiras de transformar a equação de Michaelis-Menten. As dependências gráficas são usadas no estudo da influência de várias influências externas no processo enzimático.

Esta seção de enzimologia estuda a influência de vários fatores na velocidade de uma reação enzimática. Levando em conta a equação geral de catálise enzimática da reação reversível da transformação de um substrato em um produto (1),

os principais fatores que influenciam a velocidade de uma reação enzimática devem ser nomeados: concentração do substrato [S], concentração da enzima [E] e concentração do produto da reação [P].

A interação de algumas enzimas com seu substrato pode ser descrita por uma curva hiperbólica da dependência da taxa de reação enzimática V da concentração do substrato [S] (Fig. 19):

Fig. 19. Dependência da velocidade da reação enzimática da concentração do substrato.

Três segmentos podem ser distinguidos nesta curva, o que pode ser explicado pelas posições do mecanismo de interação da enzima com o substrato: OA é o segmento da dependência diretamente proporcional de V em [S], os sítios ativos da enzima são gradualmente preenchidos com moléculas de substrato com a formação de um complexo instável ES; seção AB - dependência curvilínea de V em [S], a saturação completa dos centros ativos da enzima com moléculas de substrato ainda não foi alcançada. O complexo ES antes de atingir o estado de transição é instável, a probabilidade de dissociação para E e S ainda é alta; seção BC - a dependência é descrita por uma equação de ordem zero, a seção é paralela ao eixo [S], a saturação completa de enzimas ativas com moléculas de substrato é alcançada, V=V max .

A forma característica da curva é descrita matematicamente pela equação de Briggs-Haldane:

V=V max ● [S]/Km + [S] (2),

onde Km é a constante de Michaelis-Menten, numericamente igual à concentração de substrato na qual a velocidade da reação enzimática é igual a metade de Vmax.

Quanto menor o K m da enzima, maior a afinidade da enzima pelo substrato, mais rápido o estado de transição para o substrato é alcançado e ele se transforma em um produto de reação. A busca de valores de Km para cada um dos substratos da enzima com especificidade de grupo é importante na determinação do papel biológico desta enzima na célula.

Para a maioria das enzimas, é impossível construir uma curva hiperbólica (Fig. 19). Neste caso, o método recíproco duplo (Lineweaver-Burk) é usado, ou seja, uma dependência gráfica de 1/[V] em 1/[S] é plotada (Fig. 20). O método de construção dessas curvas em um experimento é muito conveniente ao estudar o efeito de vários tipos de inibidores na atividade das enzimas (veja o texto abaixo).

Fig.20. Gráfico de 1/[V] versus 1/[S] (método Lineweaver-Burk),

onde y área de corte - , e x - área de corte - , a tangente do ângulo α - .

Dependência da taxa de reação enzimática V da concentração da enzima [E].

Essa dependência gráfica (Fig. 21) é considerada na temperatura e pH ótimos do ambiente, em concentrações de substrato que são significativamente maiores que a concentração de saturação dos sítios ativos da enzima.

Arroz. 21. Influência da concentração enzimática na velocidade da reação enzimática.

Dependência da taxa de reação enzimática da concentração do cofator ou coenzima. Para enzimas complexas, deve-se ter em mente que a deficiência de formas coenzimáticas de vitaminas na hipovitaminose, uma violação da ingestão de íons metálicos no corpo necessariamente leva a uma diminuição na concentração das enzimas correspondentes necessárias para o curso do metabolismo processos. Portanto, deve-se concluir que a atividade da enzima é diretamente dependente da concentração do cofator ou coenzima.

Influência da concentração de produtos na velocidade da reação enzimática. Para reações reversíveis que ocorrem no corpo humano, deve-se levar em consideração que os produtos da reação direta podem ser utilizados pela enzima como substratos para a reação inversa. Portanto, a direção do fluxo e o momento de atingir Vmax são dependentes da razão entre as concentrações dos substratos iniciais e dos produtos da reação. Por exemplo, a atividade da alanina aminotransferase, que catalisa a transformação:

Alanina + Alfa-cetoglutarato ↔ Piruvato + Glutamato

depende na célula da proporção de concentrações:

[alanina + alfa-cetoglutarato] / [piruvato + glutamato].

MECANISMO DE AÇÃO ENZIMÁTICA. TEORIAS DE CATÁLISE ENZIMATIVA

As enzimas, como os catalisadores não proteicos, aumentam a velocidade de uma reação química devido à sua capacidade de diminuir a energia de ativação dessa reação. A energia de ativação de uma reação enzimática é calculada como a diferença entre o valor da energia no sistema da reação em andamento que atingiu o estado de transição e a energia determinada no início da reação (veja a dependência gráfica na Fig. 22).

Arroz. 22. Dependência gráfica do estado de energia de uma reação química sem enzima (1) e na presença de uma enzima (2) no tempo da reação.

Os trabalhos de V. Henry e, em particular, L. Michaelis, M. Menten sobre o estudo do mecanismo de reações enzimáticas reversíveis de monosubstrato tornaram possível postular que a enzima E primeiro se combina reversivelmente e relativamente rapidamente com seu substrato S para formar um complexo enzima-substrato (ES):

E+S<=>ES (1)

A formação de ES ocorre devido a ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas, hidrofóbicas, em alguns casos covalentes, ligações de coordenação entre os radicais laterais dos resíduos de aminoácidos do centro ativo e os grupos funcionais do substrato. Em enzimas complexas, a parte não proteica da estrutura também pode desempenhar a função de contato com o substrato.

O complexo enzima-substrato então se decompõe em uma segunda reação reversível mais lenta para formar o produto de reação P e a enzima livre E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

Atualmente, graças ao trabalho dos cientistas acima mencionados, bem como Kaylin D., Chance B., Koshland D. (a teoria da "conformidade induzida"), existem disposições teóricas sobre quatro pontos principais no mecanismo de ação enzimática sobre o substrato, que determina a capacidade das enzimas de acelerar reações químicas.

1. Orientação e proximidade . A enzima é capaz de ligar a molécula de substrato de tal forma que a ligação atacada pela enzima não está apenas localizada na vizinhança imediata do grupo catalítico, mas também corretamente orientada em relação a ele. A probabilidade de que o complexo ES atinja o estado de transição devido à orientação e abordagem é bastante aumentada.

2. Tensão e deformação : ajuste induzido. A fixação do substrato pode causar alterações conformacionais na molécula da enzima, que levam à tensão na estrutura do sítio ativo, bem como deformam um pouco o substrato ligado, facilitando assim a obtenção do estado de transição pelo complexo ES. Existe uma chamada correspondência induzida entre as moléculas E e S.

TRABALHO DO CURSO

Cinética das reações enzimáticas

Introdução

A base da vida de qualquer organismo são os processos químicos. Quase todas as reações em um organismo vivo ocorrem com a participação de biocatalisadores naturais - enzimas.

Berzelius em 1835 sugeriu pela primeira vez que as reações de um organismo vivo são realizadas devido a uma nova força, que ele chamou de "catalítica". Ele fundamentou essa ideia principalmente por uma observação experimental: a diastase da batata hidrolisa o amido mais rapidamente que o ácido sulfúrico. Já em 1878, Kuhne chamou uma substância que tem poder catalítico em um organismo vivo de enzima.

A cinética de ação enzimática é um ramo da enzimologia que estuda a dependência da velocidade de uma reação catalisada por enzimas da natureza química e das condições de interação do substrato com a enzima, bem como de fatores ambientais. Em outras palavras, a cinética das enzimas permite compreender a natureza dos mecanismos moleculares de ação dos fatores que afetam a taxa de catálise enzimática. Esta seção foi formada na intersecção de ciências como bioquímica, física e matemática. A primeira tentativa de descrever matematicamente as reações enzimáticas foi feita por Duclos em 1898.

De facto, esta secção sobre o estudo das enzimas é muito importante no nosso tempo, nomeadamente para a medicina prática. Dá aos farmacologistas uma ferramenta para alterar o metabolismo celular, um grande número de produtos farmacêuticos e vários venenos - estes são inibidores de enzimas.

O objetivo deste trabalho é considerar a questão da dependência da velocidade da reação em vários fatores, como a velocidade da reação pode ser controlada e como ela pode ser determinada.

1. Cinética de Michaelis-Menten

Experimentos preliminares no estudo da cinética das reações enzimáticas mostraram que a velocidade da reação, ao contrário das expectativas teóricas, não depende da concentração da enzima (E) e substrato (S) da mesma forma que no caso de uma reação convencional. reação de segunda ordem.

Brown e, independentemente dele, Henri foram os primeiros a formular uma hipótese sobre a formação de um complexo enzima-substrato durante a reação. Então esta suposição foi confirmada por três fatos experimentais:

a) a papaína formou um composto insolúvel com a fibrina (Wurtz, 1880);

b) o substrato da invertase sacarose poderia proteger a enzima da desnaturação térmica (O'Sullivan e Thompson, 1890);

c) as enzimas demonstraram ser catalisadores estereoquimicamente específicos (Fischer, 1898-1899).

Eles introduziram o conceito de velocidade máxima e mostraram que curva de saturação(ou seja, a dependência da taxa de reação na concentração do substrato) é uma hipérbole isósceles. Eles provaram que a velocidade máxima observada é uma das assíntotas da curva, e o segmento cortado no eixo x (na região de seus valores negativos) pela segunda assíntota, ou seja, constante na equação da taxa, igual em valor absoluto à concentração de substrato necessária para atingir metade da taxa máxima.

Michaelis e Menten sugeriram que a taxa de reação é determinada pela quebra do complexo ES, i.e. constante k 2 . Isso só é possível sob a condição de que k 2 é a menor das constantes de velocidade. Neste caso, o equilíbrio entre o complexo enzima-substrato, a enzima livre e o substrato é estabelecido rapidamente em relação à velocidade da reação (equilíbrio rápido).

A velocidade inicial da reação pode ser expressa pela seguinte fórmula:

v = k2

Como a constante de dissociação do complexo enzima-substrato é

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

então a concentração da enzima livre pode ser expressa como

[E]=K S / [S]

A concentração total da enzima na mistura de reação é determinada pela fórmula

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

A reação atinge sua velocidade máxima quando a concentração do substrato é alta o suficiente para que todas as moléculas da enzima estejam na forma de um complexo ES (um excesso infinitamente grande de substrato). A relação entre a velocidade inicial e a velocidade máxima teoricamente possível é igual à relação de [ES] para [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Esta é a equação clássica Michaelis e Menten, que, desde sua publicação em 1913, tem sido o princípio fundamental de todos os estudos de cinética enzimática por décadas e, com algumas limitações, permanece assim até hoje.

Mais tarde foi mostrado que a equação original de Michaelis-Menten tinha várias restrições. É justo, ou seja. descreve corretamente a cinética de uma reação catalisada por uma determinada enzima somente se todas as seguintes condições restritivas forem atendidas:

) forma-se um complexo enzima-substrato cineticamente estável;

) constante K S é a constante de dissociação do complexo enzima-substrato: isso só é verdade se ;

) a concentração do substrato não muda durante a reação, ou seja, a concentração do substrato livre é igual à sua concentração inicial;

) o produto da reação é rapidamente clivado da enzima, ou seja, nenhuma quantidade cineticamente significativa do complexo ES é formada;

) a segunda etapa da reação é irreversível; mais precisamente, levamos em conta apenas a velocidade inicial, quando a reação de retorno (devido à real falta de produto) ainda pode ser desprezada;

) apenas uma molécula de substrato se liga a cada sítio ativo da enzima;

) para todos os reagentes, suas concentrações podem ser usadas em vez de atividades.

A equação de Michaelis-Menten serve como ponto de partida para qualquer descrição quantitativa da ação das enzimas. Deve-se enfatizar que o comportamento cinético da maioria das enzimas é muito mais complicado do que decorre do esquema idealizado subjacente à equação de Michaelis-Menten. Ao derivar esta equação, assume-se que existe apenas um complexo enzima-substrato. Enquanto isso, na realidade, na maioria das reações enzimáticas, pelo menos dois ou três desses complexos são formados, surgindo em uma determinada sequência.

Aqui, EZ denota o complexo correspondente ao verdadeiro estado de transição, e EP denota o complexo entre a enzima e o produto da reação. Pode-se destacar também que na maioria das reações enzimáticas mais de um substrato está envolvido e dois ou mais produtos são formados, respectivamente. Em uma reação com dois substratos, S 1 e S 2 , três complexos enzima-substrato podem ser formados, a saber, ES 1 , ES 2 e ES 1 S 2 . Se a reação produzir dois produtos, P 1 e P 2 , então pode haver pelo menos três complexos adicionais EP 1 , EP 2 e EP 1 P 2 . Em tais reações, existem muitas etapas intermediárias, cada uma caracterizada por sua própria constante de velocidade. A análise cinética de reações enzimáticas envolvendo dois ou mais reagentes é muitas vezes extremamente complexa e requer o uso de computadores eletrônicos. No entanto, ao analisar a cinética de todas as reações enzimáticas, o ponto de partida é sempre a equação de Michaelis-Menten discutida acima.

1.1 A natureza da constanteKna equação

equação cinética de reação enzimática

O segundo postulado afirma que a constante K S na equação é a constante de dissociação do complexo enzima-substrato.

Briggs e Haldane provaram em 1925 que a equação original de Michaelis-Menten é válida apenas para , ou seja, quando o equilíbrio do estágio elementar E+S ES é estabelecido muito rapidamente em comparação com a taxa do próximo estágio. Portanto, tais mecanismos cinéticos (obedecendo à condição inicial de Michaelis-Menten e tendo um estágio elementar lento, em relação ao qual os equilíbrios em todos os outros estágios elementares são estabelecidos rapidamente) são chamados de satisfazendo a suposição de "equilíbrio rápido". Se, no entanto, k 2 for comparável em ordem de grandeza a k -1 , a mudança na concentração do complexo enzima-substrato ao longo do tempo pode ser expressa pela seguinte equação diferencial:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Como estamos considerando a taxa de reação inicial, ou seja, o momento em que a reação inversa ainda não ocorre, e o estágio pré-estacionário já passou, então devido ao excesso de substrato, a quantidade do complexo enzima-substrato formado é igual à quantidade do decomposto ( o princípio da estacionaridade, ou a cinética de Briggs e Haldane, ou o princípio de Bodenstein em cinética química) e é verdade que

d/dt=0

Substituindo isso na equação diferencial, obtemos uma expressão para a concentração de enzima livre:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Equação de estado estacionário:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Porque v = k 2 , então temos que

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

Nesse caso

V max = k 2 [E] T

e é igual à velocidade máxima obtida pela equação de Michaelis-Menten. No entanto, a constante no denominador da equação de Michaelis-Menten não é K S , Essa. não a constante de dissociação do complexo enzima-substrato, mas a chamada Constante de Michaelis:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m é igual a K S somente se .

No caso, a constante no denominador da equação da velocidade é expressa pela fórmula

K k \u003d k 2 / k 1

e é chamado, de acordo com Van Slyke, constante cinética.

A equação de estado estacionário também pode ser obtida a partir da equação diferencial sem a suposição de que d / dt = 0. Se substituirmos o valor [E] = [E] T - na equação diferencial, após as transformações obtemos

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Para obter a equação de estado estacionário desta equação, não precisa ser d / dt = 0. Basta que a desigualdade d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

A equação do estado estacionário diferenciado fica assim:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Esta expressão obviamente não é igual a 0.

1.2 Transformação da equação de Michaelis-Menten

A equação original de Michaelis-Menten é uma equação hiperbólica, onde uma das constantes (V max) é a assíntota da curva. Outra constante (K m), cujo valor negativo é determinado pela segunda assíntota, é igual à concentração de substrato necessária para atingir V max / 2. Isso é fácil de verificar, pois se

v=Vmax/2, então

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], ou seja, [S] = K m para v = V max /2.

A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada algebricamente em outras formas que são mais convenientes para a representação gráfica de dados experimentais. Uma das transformações mais comuns é simplesmente igualar os recíprocos dos lados esquerdo e direito da equação

Como resultado da transformação, obtemos a expressão

que leva o nome Equações Lineweaver-Burk. De acordo com esta equação, um gráfico plotado nas coordenadas 1/[S] e 1/v é uma linha reta, cuja inclinação é igual a K m /V max , e o segmento cortado no eixo y é igual a 1/V máx. Um tal gráfico recíproco duplo tem a vantagem de permitir determinar Vmax com mais precisão; em uma curva plotada nas coordenadas [S] ev, V max é uma quantidade assintótica e é determinada com muito menos precisão. O segmento cortado no eixo x no gráfico Lineweaver-Burk é igual a -1/K m . Informações valiosas sobre a inibição enzimática também podem ser extraídas deste gráfico.

Outra transformação da equação de Michaelis-Menten é que ambos os lados da equação de Lineweaver-Burk são multiplicados por V max *v e após algumas transformações adicionais obtemos

O gráfico correspondente em coordenadas v e v/[S] representa com e 4, fig. 1]. Esse gráfico ( Gráfico de Edie-Hofsty) não só permite determinar com muita facilidade os valores de V max e K m , mas também permite identificar possíveis desvios de linearidade que não são detectados no gráfico de Lineweaver-Burk.

A equação também pode ser linearizada de outra forma

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

Neste caso, a dependência [S] / v em [S] deve ser construída. A inclinação da linha reta resultante é 1/V max; os segmentos cortados nos eixos das ordenadas e das abcissas são iguais a (K m / V max) e (- K m), respectivamente. Este gráfico tem o nome do autor gráfico de Haynes.

A análise estatística mostrou que os métodos de Edie-Hofstee e Haynes fornecem resultados mais precisos do que o método de Lineweaver-Burk. A razão para isso é que nos gráficos de Edie - Hofstee e Haynes, as variáveis ​​dependentes e independentes estão incluídas nos valores plotados em ambos os eixos de coordenadas.

1.3 Efeito da concentração do substrato na cinética da reação

Em muitos casos, a condição de concentração constante do substrato não é satisfeita. Por um lado, um excesso do substrato não é usado na reação in vitro com algumas enzimas devido à frequente inibição da atividade enzimática do substrato. Neste caso, somente sua concentração ótima pode ser utilizada, e isso nem sempre fornece o excesso de substrato necessário para cumprir as equações cinéticas dos mecanismos discutidos acima. Além disso, na célula in vivo, o excesso de substrato necessário para cumprir essa condição geralmente não é alcançado.

Em reações enzimáticas onde o substrato não está em excesso e, portanto, sua concentração muda durante a reação, a constante de dissociação do complexo enzima-substrato é

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - concentração de substrato em t = 0). Neste caso, a taxa de reação inicial (no estado estacionário) é dada por

v= V max / (K m + )

onde é a concentração do substrato em um ponto no tempo.

No entanto, é possível escrever uma solução aproximada para dois casos em que [S] o = :

) se esta desigualdade for satisfeita devido a grandes valores de t, ou seja, quando mais de 5% da concentração inicial do substrato foi consumida durante a reação;

), se a concentração da enzima não puder ser desprezada em relação à concentração do substrato e, portanto, a concentração do complexo enzima-substrato deve ser levada em consideração.

Se t for grande e a concentração for desprezível em comparação com [S] 0 , então a equação para a constante de dissociação do complexo enzima-substrato se torna a seguinte:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Para o valor da concentração , que muda durante a reação, o valor ([S] 0 + )/2 serve como uma aproximação satisfatória. Sendo = [S] 0 - [P], a velocidade média; pode ser expresso como

Substituindo esta expressão e o valor aproximado em

v= V max / (K m + ),

Nós temos:

Ao comparar os valores calculados com base nessa aproximação com os valores obtidos da equação exata e integrada de Michaelis-Menten, verifica-se que o erro na determinação de K m é de 1 e 4% ao gastar 30 e 50% do substrato, respectivamente. Portanto, o erro nesta aproximação é desprezível em comparação com o erro de medição.

Quando o consumo do substrato não excede 5% da concentração inicial, mas a concentração da enzima é tão alta que não pode ser ignorada em relação a [S] 0, a constante de dissociação do complexo enzima-substrato é igual a:

Ks = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Sua solução sobre dá

Das duas soluções possíveis, apenas a negativa pode ser escolhida, pois somente ela satisfaz as condições iniciais: = 0 em [S] 0 = 0 ou [E] T = 0. Por analogia com a equação para a razão v/V max, obtivemos a equação da velocidade inicial. A equação quadrática obtida a partir da equação da constante de dissociação do complexo enzima-substrato, encontrada logo acima, usando as fórmulas v \u003d k 2 e V max \u003d k 2 [E] T, pode ser reduzida para a seguinte forma:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Dois casos limites devem ser considerados. No primeiro caso [S]<

v = (Vmax / Km) [S] = k[S]

Assim, obtivemos a reação aparente de primeira ordem e k=V max /K m - a constante cinética aparente de primeira ordem. Sua dimensão real é o tempo -1 , mas é uma combinação das constantes de velocidade de primeira e segunda ordem de vários estágios elementares, ou seja, k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . Sob condições de primeira ordem aparente k é uma medida do progresso da reação.

Outro caso limite: [S] >> Km. Aqui a constante K m é desprezível em comparação com [S], e assim obtemos v = V max .

1.4 Formação de um complexo enzima-produto cineticamente estável

Se um complexo enzima-produto cineticamente estável é formado durante a reação, o mecanismo de reação é o seguinte:

Aplicando a suposição de estado estacionário, podemos escrever as equações diferenciais:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Destas equações segue que

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Como v = k 3

e [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ((k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

Nós temos

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Ou seja

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

Nesse caso, já é muito difícil calcular os valores específicos das constantes de taxa individuais, pois apenas sua proporção pode ser medida diretamente. A situação fica ainda mais complicada quando o mecanismo da reação enzimática se torna mais complexo, quando mais de dois complexos estão envolvidos na reação, porque o número de constantes de velocidade na equação, é claro, é muito maior, e suas razões também são mais complicado.

No entanto, a situação é simplificada se, após a reação reversível da formação do primeiro complexo, as etapas elementares subsequentes forem irreversíveis. Importantes representantes de enzimas que obedecem a esse mecanismo são as enzimas proteolíticas e as esterases. Seu mecanismo de reação pode ser escrito da seguinte forma:

em que ES» é um intermediário acil-enzima que se decompõe por exposição à água. Nós podemos escrever

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) \u003d k cat [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 gato / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

A constante de Michaelis da etapa de acilação é K m "K s. Quanto maior a razão k cat / K m , maior a especificidade do substrato.

A determinação das constantes é bastante simplificada se o experimento for realizado na presença de um agente nucleofílico (N) capaz de competir com a água. Então

k 3 \u003d k 3 ’ e P i (i \u003d 1, 2, 3) são produtos.

v i = k gato, i [S] / (K m + [S]) gato, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) gato, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) gato, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Como se sabe que K s / k 2 = K m / k cat, e se o nucleófilo estiver ausente, então

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

e para determinar as constantes, você pode usar o ponto de intersecção das linhas nas coordenadas 1/v N (e 1/v) - 1/[S]. Duas linhas retas em coordenadas inversas duplas se cruzam no segundo quadrante. Na ausência de um nucleófilo, o ponto de intersecção da linha com o eixo vertical é definido como 1/V max e 1/k cat , e com o eixo horizontal como -1/K m . As coordenadas do ponto de intersecção de duas linhas: -1/K se 1/k 3 . A distância entre 1/V max e 1/k 3 é 1/k 2 .

1.5 Análise da curva cinética de reação completa

A equação de Michaelis-Menten em sua forma original refere-se apenas a reações irreversíveis, ou seja, para reações onde apenas a velocidade inicial é considerada, e a reação inversa não aparece devido a uma quantidade insuficiente do produto e não afeta a velocidade da reação. No caso de uma reação irreversível, a curva cinética completa pode ser facilmente analisada (para um intervalo de tempo arbitrário t ), integrando a equação original de Michaelis-Menten. Neste caso, portanto, permanece a suposição de que apenas um complexo intermediário enzima-substrato é formado no decorrer da reação. Como para o intervalo de tempo t não há restrições, a concentração do substrato no momento da análise não pode ser igual à concentração inicialmente introduzida. Assim, também é necessário levar em conta a mudança em [S] durante o curso da reação. Seja S 0 a concentração inicial do substrato, (S 0 - y ) - concentração no tempo t . Então, com base na equação original de Michaelis-Menten (se y é a quantidade de substrato convertido), podemos escrever

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Tomando os recíprocos e dividindo as variáveis, integramos sobre y entre 0 e y (V max é indicado como V):

(2,303 / t) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Assim, tendo traçado a dependência do lado esquerdo da equação em y / t (coordenadas de Foster-Niemann) , obter uma linha reta com inclinação (-1/K m) , segmento de corte no eixo y (V/K m) , e no eixo das abcissas - o segmento V. A equação integral também pode ser linearizada de uma maneira diferente:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

ou t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Se estamos estudando uma reação reversível, é necessário prestar atenção em qual intervalo de tempo estamos lidando. No momento da mistura da enzima com o substrato, inicia-se a chamada fase pré-estacionária, com duração de vários micro ou milissegundos, durante a qual se formam os complexos enzima-substrato correspondentes ao estado estacionário. No estudo de reações reversíveis em intervalos de tempo suficientemente longos, esta fase não desempenha um papel significativo, pois nesta fase a reação não ocorre a toda velocidade em nenhuma das direções.

Para uma reação que ocorre da esquerda para a direita, os complexos enzima-substrato envolvidos na reação atingem a concentração limitante da velocidade apenas no final da fase pré-estacionária. Estado quase estacionário, em que as concentrações dos complexos enzima-substrato determinantes da taxa se aproximam dos valores máximos das concentrações no estado estacionário, dura alguns décimos de segundo ou um segundo. Durante esta fase, a taxa de formação do produto (ou consumo de substrato) é quase linear no tempo. Teoricamente, a formação do produto ainda não ocorreu aqui, mas na prática sua concentração é tão baixa que a velocidade da reação inversa não afeta a velocidade da reação direta. Essa fase linear é chamada de taxa de reação inicial, e até agora só a levamos em consideração.

A reação da direita para a esquerda na próxima fase também é acelerada devido ao aumento gradual da concentração do produto. (Estado de transição; a linearidade observada até agora no tempo desaparece). Esta fase continua até que a velocidade da reação da esquerda para a direita se torne igual à velocidade da reação da direita para a esquerda. Este é o estado equilíbrio dinâmico, porque a reação continua em ambas as direções na mesma velocidade.

2. Fatores dos quais a velocidade da reação enzimática depende

.1 Dependência da taxa de reação enzimática da temperatura

Com o aumento da temperatura do meio, a velocidade da reação enzimática aumenta, atingindo um máximo em alguma temperatura ótima, e então cai para zero. Para reações químicas, existe uma regra que, com um aumento de temperatura de 10 ° C, a taxa de reação aumenta de duas a três vezes. Para reações enzimáticas, esse coeficiente de temperatura é menor: para cada 10°C, a taxa de reação aumenta por um fator de 2 ou até menos. A diminuição subsequente na taxa de reação para zero indica a desnaturação do bloco enzimático. Os valores ideais de temperatura para a maioria das enzimas estão na faixa de 20 a 40 0 ​​C. A termolabilidade das enzimas está associada à sua estrutura proteica. Algumas enzimas já são desnaturadas a uma temperatura de cerca de 40 0 ​​C, mas a maioria delas é inativada a temperaturas acima de 40 - 50 0 C. Algumas enzimas são inativadas pelo frio, ou seja, a temperaturas próximas de 0°C, ocorre a desnaturação.

Um aumento da temperatura corporal (febre) acelera as reações bioquímicas catalisadas por enzimas. É fácil calcular que um aumento na temperatura corporal para cada grau aumenta a taxa de reação em cerca de 20%. Em altas temperaturas de cerca de 39-40°C, o desperdício de substratos endógenos nas células de um organismo doente é necessário para reabastecer sua ingestão com alimentos. Além disso, a uma temperatura de cerca de 40°C, algumas das enzimas termolábeis podem ser desnaturadas, o que interrompe o curso natural dos processos bioquímicos.

A baixa temperatura causa uma inativação reversível das enzimas devido a uma ligeira mudança em sua estrutura espacial, mas suficiente para romper a configuração correspondente do centro ativo e das moléculas do substrato.

2.2 Dependência da taxa de reação do pH do meio

Para a maioria das enzimas, existe um certo valor de pH no qual sua atividade é máxima; acima e abaixo desse valor de pH, a atividade dessas enzimas diminui. No entanto, nem em todos os casos as curvas que descrevem a dependência da atividade enzimática do pH são em forma de sino; às vezes essa dependência também pode ser expressa diretamente. A dependência da taxa de reação enzimática com o pH indica principalmente o estado dos grupos funcionais do centro ativo da enzima. A alteração do pH do meio afeta a ionização de grupos ácidos e básicos de resíduos de aminoácidos do centro ativo, que estão envolvidos tanto na ligação do substrato (na área de contato) quanto em sua transformação (na área catalítica). Portanto, o efeito específico do pH pode ser causado por uma mudança na afinidade do substrato pela enzima, ou por uma mudança na atividade catalítica da enzima, ou ambos.

A maioria dos substratos tem grupos ácidos ou básicos, então o pH afeta o grau de ionização do substrato. A enzima liga-se preferencialmente à forma ionizada ou não ionizada do substrato. Obviamente, em pH ótimo, ambos os grupos funcionais do centro ativo estão no estado mais reativo, e o substrato está em uma forma que é preferível para a ligação desses grupos da enzima.

Ao construir curvas que descrevem a dependência da atividade enzimática do pH, as medições em todos os valores de pH geralmente são realizadas em condições de saturação da enzima com o substrato, pois o valor de K m para muitas enzimas muda com o pH.

A curva que caracteriza a dependência da atividade enzimática do pH pode ter uma forma particularmente simples nos casos em que a enzima atua em substratos eletrostaticamente neutros ou em substratos nos quais grupos carregados não desempenham um papel significativo no ato catalítico. Um exemplo dessas enzimas é a papaína, assim como a invertase, que catalisa a hidrólise de moléculas neutras de sacarose e mantém uma atividade constante na faixa de pH de 3,0-7,5.

O valor de pH correspondente à atividade máxima da enzima não coincide necessariamente com o valor de pH característico do ambiente intracelular normal desta enzima; o último pode estar acima e abaixo do pH ótimo. Isso sugere que o efeito do pH na atividade enzimática pode ser um dos fatores responsáveis ​​pela regulação da atividade enzimática dentro da célula. Como a célula contém centenas de enzimas, e cada uma delas reage de maneira diferente às mudanças no pH, o valor do pH dentro da célula talvez seja um dos elementos importantes no complexo sistema de regulação do metabolismo celular.

2.3 Determinando a quantidade da enzima por sua atividade

) a estequiometria total da reação catalisada;

) a possível necessidade de cofatores - em íons metálicos ou coenzimas;

) a dependência da atividade enzimática das concentrações do substrato e do cofator, ou seja, Valores de K m para substrato e cofator;

) o valor de pH correspondente à atividade máxima da enzima;

) a faixa de temperatura na qual a enzima é estável e retém alta atividade.

Além disso, é necessário ter à sua disposição alguma técnica analítica bastante simples que permita determinar a taxa de desaparecimento do substrato ou a taxa de aparecimento dos produtos da reação.

Sempre que possível, a análise enzimática é realizada sob condições padrão que mantêm o pH ótimo e mantêm uma concentração de substrato acima da concentração de saturação; neste caso, a velocidade inicial corresponde à ordem zero da reação em relação ao substrato e é proporcional apenas à concentração da enzima. Para enzimas que requerem cofatores, íons metálicos ou coenzimas, a concentração desses cofatores também deve exceder a concentração de saturação para que a concentração da enzima seja o fator limitante da velocidade. Em geral, a medição da taxa de formação do produto de reação pode ser realizada com maior precisão do que a medição da taxa de desaparecimento do substrato, uma vez que o substrato geralmente deve estar presente em concentrações relativamente altas para manter a cinética de ordem zero. A taxa de formação do produto (ou produtos) da reação pode ser medida por métodos químicos ou espectrofotométricos. O segundo método é mais conveniente, pois permite registrar continuamente o curso da reação no ácaro do gravador.

Por acordo internacional, uma unidade de atividade enzimática é a quantidade de enzima capaz de causar a conversão de um micromole de substrato por minuto a 25°C em condições ótimas. Atividade específica enzima é o número de unidades de atividade enzimática por 1 mg de proteína. Este valor é utilizado como critério de pureza da preparação enzimática; aumenta à medida que a enzima é purificada e atinge o seu valor máximo para uma preparação idealmente pura. Debaixo número de revoluções compreender o número de moléculas de substrato que sofrem transformação por unidade de tempo por uma molécula da enzima (ou por um sítio ativo) sob condições em que a taxa de reação é limitada pela concentração da enzima.

2.4 Ativação enzimática

A regulação das enzimas pode ser realizada pela interação com elas de vários componentes biológicos ou compostos estranhos (por exemplo, drogas e venenos), que são comumente chamados de modificadores ou reguladores enzimas. Sob a influência de modificadores na enzima, a reação pode ser acelerada (ativadores) ou desacelerada ( inibidores).

A ativação das enzimas é determinada pela aceleração das reações bioquímicas que ocorrem após a ação do modificador. Um grupo de ativadores consiste em substâncias que afetam a região do sítio ativo da enzima. Estes incluem cofatores enzimáticos e substratos. Os cofatores (íons metálicos e coenzimas) não são apenas elementos estruturais obrigatórios de enzimas complexas, mas também essencialmente seus ativadores.

Os íons metálicos são ativadores bastante específicos. Muitas vezes, algumas enzimas requerem íons não de um, mas de vários metais. Por exemplo, para Na + , K + -ATPase, que transporta cátions monovalentes através da membrana celular, os íons magnésio, sódio e potássio são necessários como ativadores.

A ativação com a ajuda de íons metálicos é realizada por diferentes mecanismos. Em algumas enzimas, eles fazem parte do sítio catalítico. Em alguns casos, os íons metálicos facilitam a ligação do substrato ao centro ativo da enzima, formando uma espécie de ponte. Muitas vezes, o metal não se combina com a enzima, mas com o substrato, formando um complexo metal-substrato, que é preferível para a ação da enzima.

A especificidade da participação das coenzimas na ligação e catálise do substrato explica a ativação de reações enzimáticas por elas. O efeito ativador dos cofatores é especialmente perceptível ao atuar em uma enzima que não está saturada com cofatores.

O substrato também é um ativador dentro de limites de concentração conhecidos. Após atingir concentrações saturantes do substrato, a atividade da enzima não aumenta. O substrato aumenta a estabilidade da enzima e facilita a formação da conformação desejada do sítio ativo da enzima.

Íons metálicos, coenzimas e seus precursores e análogos ativos,

substratos podem ser usados ​​na prática como preparações que ativam enzimas.

A ativação de algumas enzimas pode ser realizada por modificação que não afeta o centro ativo de suas moléculas. Várias modificações são possíveis:

1) ativação de um predecessor inativo - proenzima, ou zimogênio. Por exemplo, a conversão de pepsinogênio em pepsina ;

2) ativação pela ligação de qualquer grupo modificador específico à molécula da enzima;

3) ativação por dissociação de uma proteína complexa inativa - enzima ativa.

2.5 Inibição enzimática

Existem reagentes que podem interagir mais ou menos especificamente com uma ou outra cadeia lateral de proteínas, o que leva à inibição da atividade enzimática. Este fenômeno permite estudar a natureza dos resíduos laterais de aminoácidos envolvidos nesta reação enzimática. No entanto, na prática, deve-se levar em conta inúmeras sutilezas que tornam uma interpretação inequívoca dos resultados obtidos com inibidores específicos bastante difícil e muitas vezes duvidosa. Em primeiro lugar, para que a reação com um inibidor seja adequada para estudar a natureza das cadeias laterais envolvidas na reação, ela deve atender aos seguintes critérios:

) ser específico, ou seja. o inibidor deve bloquear apenas os grupos desejados;

) inibem a atividade da enzima, e essa inibição deve se completar com o aumento do número de grupos modificados;

) o reagente não deve causar desnaturação não específica da proteína.

Existem 2 grupos de inibidores: ação reversível e irreversível. A divisão é baseada no critério para a restauração da atividade enzimática após a diálise ou uma forte diluição de uma solução enzimática com um inibidor.

De acordo com o mecanismo de ação, distinguem-se a inibição competitiva, não competitiva, não competitiva, de substrato e alostérica.

Inibição competitiva

A inibição competitiva foi descoberta no estudo da inibição causada por análogos do substrato. Esta é a inibição da reação enzimática causada pela ligação ao centro ativo da enzima de um inibidor de estrutura semelhante ao substrato e impedindo a formação de um complexo enzima-substrato. Na inibição competitiva, o inibidor e o substrato, sendo semelhantes em estrutura, competem pelo sítio ativo da enzima. O composto de moléculas, que é maior, liga-se ao centro ativo.

Tais idéias sobre o mecanismo de inibição foram confirmadas por experimentos sobre a cinética das reações de inibição competitivas. Assim, foi demonstrado que, no caso de inibição competitiva, o análogo do substrato não afeta a taxa de decomposição do complexo enzima-substrato já formado; ao usar um excesso “infinitamente grande” do substrato, a mesma taxa máxima é obtida tanto na presença quanto na ausência de um inibidor. Pelo contrário, o inibidor afeta o valor da constante de dissociação e a constante de Michaelis. A partir disso, podemos concluir que o inibidor reage com grupos proteicos envolvidos de uma forma ou de outra na ligação ao substrato, portanto, devido à sua interação com esses grupos, a força de ligação do substrato diminui (ou seja, o número de moléculas enzimáticas capazes de ligando o substrato diminui).

Mais tarde, foi demonstrado que a inibição cineticamente competitiva pode ser causada não apenas por análogos de substrato, mas também por outros reagentes, cuja estrutura química é completamente diferente daquela do substrato. Nestes casos, assumiu-se também que este reagente interage com o grupo responsável pela ligação do substrato.

Existem teoricamente duas possibilidades de inibição competitiva:

1) os sítios de ligação e catalíticos da enzima se sobrepõem; o inibidor se liga a eles, mas afeta apenas os grupos do centro de ligação;

2) o centro de ligação e o centro catalítico na molécula da enzima são isolados espacialmente; o inibidor interage com o sítio de ligação.

onde I é um inibidor e K I é a constante de dissociação do complexo enzima-inibidor.

Taxa relativa (razão da taxa de reação enzimática medida na presença de um inibidor (v i) , à velocidade máxima) é igual a

v i / V = ​​/ [E] T

uma vez que para a concentração total da enzima é verdade

[E]T = [E] + +

então 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Obviamente, se [I] = K I , então a inclinação da linha reta torna-se duas vezes maior do que para a dependência de 1/v 0 em [S] (v 0 é a velocidade da reação enzimática na ausência de um inibidor).

O tipo de inibição é geralmente determinado graficamente. A inibição competitiva é mais facilmente reconhecida traçando gráficos de Lineweaver-Burk (ou seja, gráficos em 1/v i e 1/[S]) em diferentes concentrações de inibidor. Com a verdadeira inibição competitiva, obtém-se um conjunto de linhas retas que diferem na tangente do ângulo de inclinação e interceptam o eixo y (eixo 1/v i) em um ponto. Em qualquer concentração do inibidor, é possível usar uma concentração tão alta do substrato que a atividade da enzima será máxima.

Um exemplo de inibição competitiva é o efeito de várias substâncias na atividade da succinato desidrogenase. Esta enzima faz parte do sistema cíclico enzimático - o ciclo de Krebs. Seu substrato natural é o succinato, e seu inibidor competitivo é o oxaloacetato, um produto intermediário do mesmo ciclo de Krebs:

Um inibidor competitivo semelhante da succinato desidrogenase é o ácido malônico, que é frequentemente usado em pesquisas bioquímicas.

A ação de muitas preparações farmacológicas, pesticidas usados ​​para destruir pragas agrícolas e agentes de guerra química é baseada no princípio da inibição competitiva.

Por exemplo, um grupo de drogas anticolinesterase, que inclui derivados de bases quaternárias de amônio e compostos organofosforados, são inibidores competitivos da enzima colinesterase em relação ao seu substrato acetilcolina. A colinesterase catalisa a hidrólise da acetilcolina, um mediador dos sistemas colinérgicos (sinapses neuromusculares, sistema parassimpático, etc.). As substâncias anticolinesterase competem com a acetilcolina pelo sítio ativo da enzima, ligam-se a ela e desligam a atividade catalítica da enzima. Drogas como prozerina, fisostigmina, sevin inibem a enzima de forma reversível, enquanto drogas organofosforadas como armina, nibufina, clorofos, soman agem de forma irreversível, fosforilando o grupo catalítico da enzima. Como resultado de sua ação, a acetilcolina se acumula nas sinapses onde é um mediador da excitação nervosa, ou seja, o organismo é envenenado pela acetilcolina acumulada. A ação dos inibidores reversíveis desaparece gradualmente, pois quanto mais acetilcolina se acumula, mais rápido ele desloca o inibidor do centro ativo da colinesterase. A toxicidade dos inibidores irreversíveis é incomparavelmente maior; portanto, eles são usados ​​para combater pragas agrícolas, insetos domésticos e roedores (por exemplo, clorofos) e como agentes de guerra química (por exemplo, sarin, soman, etc.).

Inibição não competitiva

Na inibição não competitiva, um inibidor específico não afeta a constante de dissociação do complexo enzima-substrato. Por outro lado, a taxa de reação máxima alcançável é menor na presença de um inibidor do que na sua ausência, mesmo em um excesso infinitamente grande do substrato. A presença de inibição prova que o inibidor se liga à proteína. A invariância da constante de dissociação tanto na presença quanto na ausência do inibidor, por sua vez, indica que, diferentemente do substrato, o inibidor se liga a outro grupo. Do ponto de vista teórico, o mecanismo de tal inibição pode ser interpretado de várias maneiras.

a) O sítio de ligação e o sítio catalítico da enzima são diferentes. Neste caso, o inibidor associado ao centro catalítico reduz a atividade da enzima e o máximo atingível
velocidade sem afetar a formação do complexo enzima-substrato.

b) O sítio de ligação e o sítio catalítico se sobrepõem
superfície da enzima, e o inibidor se liga a outros grupos da proteína. Devido à ligação do inibidor à superfície da enzima, a informação da proteína muda e se torna desfavorável para a realização da catálise.

c) O inibidor não se liga ao sítio catalítico nem ao sítio de ligação e, portanto, não afeta a conformação da proteína. No entanto, pode alterar localmente a distribuição de carga em uma região da superfície da proteína. A inibição da atividade também pode ocorrer neste caso, se, por exemplo, a ionização de grupos essenciais para a manifestação da atividade for impossibilitada, ou se, pelo contrário, ocorrer a ionização de grupos ativos apenas na forma não ionizada. Este fenômeno é observado principalmente quando se utilizam reagentes fortemente ácidos ou fortemente alcalinos.

O inibidor e o substrato não afetam a ligação um do outro à enzima, mas os complexos enzimáticos que contêm o inibidor são completamente inativos. Neste caso, as seguintes etapas elementares podem ser assumidas:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Se [I] = K I, as inclinações das retas e as ordenadas do ponto de interseção com o eixo vertical são duplicadas em relação a 1/v 0 .

Os inibidores não competitivos são, por exemplo, os cianetos, que estão fortemente associados ao ferro férrico, que faz parte do sítio catalítico da enzima hemica - citocromo oxidase. O bloqueio dessa enzima desliga a cadeia respiratória e a célula morre. Os inibidores de enzimas não competitivos incluem íons de metais pesados ​​e seus compostos orgânicos. Portanto, íons de metais pesados ​​de mercúrio, chumbo, cádmio, arsênico e outros são muito tóxicos. Eles bloqueiam, por exemplo, os grupos SH incluídos no sítio catalítico da enzima.

Os inibidores não competitivos são os cianetos, que estão fortemente associados ao ferro férrico, que faz parte do sítio catalítico da enzima hemica - citocromo oxidase. O bloqueio dessa enzima desliga a cadeia respiratória e a célula morre. É impossível remover a ação de um inibidor não competitivo com excesso de substrato (como a ação de um inibidor competitivo), mas apenas com substâncias que se ligam ao inibidor - reativadores.

Os inibidores não competitivos são usados ​​como agentes farmacológicos, substâncias tóxicas para controle de pragas na agricultura e para fins militares. Na medicina, são utilizadas preparações contendo mercúrio, arsênico, bismuto, que inibem de forma não competitiva enzimas nas células do corpo ou bactérias patogênicas, o que determina um ou outro de seus efeitos. Em caso de intoxicação, a ligação do veneno ou seu deslocamento do complexo enzima-inibidor é possível com a ajuda de reativadores. Estes incluem todos os complexones contendo SH (cisteína, dimercaptopropanol), ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético, etc.

Inibição não competitiva

Esse tipo de inibição também é chamado na literatura de inibição anticompetitiva. ou inibição associada , no entanto, o termo "inibição não competitiva" é o mais utilizado. A característica desse tipo de inibição é que o inibidor não é capaz de se ligar à enzima, mas se liga ao complexo enzima-substrato.

No caso de inibição não competitiva, o complexo que contém o inibidor é inativo:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

inibição de substrato

A inibição de substrato é a inibição de uma reação enzimática causada por um excesso de substrato. Tal inibição ocorre devido à formação de um complexo enzima-substrato que não é capaz de sofrer transformações catalíticas O complexo ES 2 é improdutivo e inativa a molécula enzimática. A inibição do substrato é causada por um excesso do substrato, portanto, ele é removido quando sua concentração diminui.

Inibição alostérica

A regulação alostérica é característica apenas para um grupo especial de enzimas com estrutura quaternária, que possuem centros reguladores para a ligação de efetores alostéricos. Os efetores negativos que inibem a conversão do substrato no sítio ativo da enzima atuam como inibidores alostéricos. Os efetores alostéricos positivos, ao contrário, aceleram a reação enzimática e, portanto, são chamados de ativadores alostéricos. Os efetores alostéricos de enzimas são, na maioria das vezes, vários metabólitos, bem como hormônios, íons metálicos e coenzimas. Em casos raros, o papel do efetor alostérico das enzimas é realizado por moléculas de substrato.

O mecanismo de ação dos inibidores alostéricos sobre a enzima é alterar a conformação do sítio ativo. A diminuição da velocidade da reacção enzimática é consequência de um aumento de K m ou de uma diminuição da velocidade máxima V max nas mesmas concentrações de substrato saturante, i.e. a enzima está parcialmente ociosa.

As enzimas alostéricas diferem de outras enzimas em sua curva específica em forma de S de taxa de reação versus concentração de substrato. Essa curva é semelhante à curva de saturação de oxigênio da hemoglobina; indica que os centros ativos das subunidades não funcionam de forma autônoma, mas cooperativa, ou seja, a afinidade de cada próximo centro ativo para o substrato é determinada pelo grau de saturação dos centros anteriores. O trabalho coordenado dos centros é determinado por efetores alostéricos.

A regulação alostérica se manifesta na forma de inibição pelo produto final da primeira enzima da cadeia. A estrutura do produto final após uma série de transformações da substância inicial (substrato) não é semelhante ao substrato, de modo que o produto final pode atuar na enzima inicial da cadeia apenas como um inibidor alostérico (efetor). Externamente, tal regulação é semelhante à regulação pelo mecanismo de feedback e permite controlar a saída do produto final, no caso de acúmulo do qual o trabalho da primeira enzima da cadeia é interrompido. Por exemplo, a aspartato carbamoiltransferase (ACTase) catalisa a primeira das seis reações na síntese do trifosfato de citidina (CTP). CTP é um inibidor alostérico de AKTase. Portanto, quando o CTP se acumula, ocorre a inibição da AKTase e a síntese adicional de CTP para. A regulação alostérica de enzimas com a ajuda de hormônios foi descoberta. Por exemplo, os estrogênios são um inibidor alostérico da enzima glutamato desidrogenase, que catalisa a desaminação do ácido glutâmico.

Assim, mesmo a equação cinética mais simples para uma reação enzimática contém vários parâmetros cinéticos, cada um dos quais depende da temperatura e do ambiente em que a reação ocorre.

Os inibidores permitem não apenas entender a essência da catálise enzimática, mas também são uma espécie de ferramenta para estudar o papel de reações químicas individuais, que podem ser desligadas especificamente com a ajuda de um inibidor de uma determinada enzima.

3. Alguns dispositivos úteis para determinar as taxas de reação iniciais

Muitos problemas de cinética enzimática levam à determinação das taxas iniciais de reação (v 0). A principal vantagem deste método é que os valores de v0 determinados no momento inicial darão a representação mais precisa da atividade das enzimas em estudo, uma vez que os produtos de reação acumulados ainda não têm tempo para exercer um efeito inibitório. efeito sobre a enzima e, além disso, o sistema reagente está em estado de equilíbrio estacionário.

Na prática laboratorial, no entanto, ao usar técnicas convencionais espectrofotométricas, titrimétricas ou outras para registrar o progresso de tais reações, na melhor das hipóteses, até 15-20 segundos a partir do momento inicial para introdução da enzima no substrato, misturando o sistema de reação, configurar a célula, etc. é perdido. E isso é inaceitável, pois neste caso a tangente é trazida ao ponto onde tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без a mistura constante também é complicada por flutuações nas concentrações de reagentes por volume.

Os dispositivos simples propostos abaixo para um espectrofotômetro, um medidor de pH e similares permitem reduzir significativamente as fontes dos erros indicados na determinação de v 0 .

3.1 Dispositivo para o espectrofotômetro

O dispositivo para o espectrofotômetro é composto por um dispensador 1, uma rosca giratória de Teflon 2 (um agitador) e uma tampa de fixação 3.

O dispensador é uma micropipeta, uma extremidade da qual é formada com uma agulha 4, a outra - com um alargamento 5 (para evitar que a enzima entre na ponta de borracha 6).

A tampa de teflon 3 que cobre a cuvete espectral 7 tem dois orifícios: um (8) no centro da tampa, o segundo (9) acima do meio do espaço entre a parede opaca da cuvete 7 e o feixe de luz 10. Teflon tubo 11 (diâmetro interno 1 -1,5 mm) é fixado em uma extremidade no orifício 9, a outra - em uma borda fixa 12 na frente do rotor do motor 13. A rosca de teflon 2 é inserida dentro do tubo (espessura da rosca 0,5-0,6 mm ). Uma extremidade do fio é fixada no rotor giratório do motor 13, a segunda - passada na cubeta 7 - é moldada em forma de espiral (para melhorar a mistura). A posição da rosca é determinada pela tampa de fixação 3, independentemente da distância do motor, o que é conveniente quando se trabalha com trocas frequentes de cubetas.

Princípio da Operação. A cubeta de quartzo do espectrofotômetro 7 é preenchida com substrato 14 (cerca de 1,5-2,0 ml), inserido no suporte de cubeta termostática do espectrofotômetro, fechado com uma tampa 3 com um fio de teflon rotativo 2, que é imerso no substrato 14, e todas as outras operações já são realizadas no feixe de luz do espectrofotômetro e registradas no registrador.

No início do trabalho, o substrato é misturado e a caneta do gravador escreve uma linha horizontal plana (ou “zero”). O dispensador (com a enzima) é inserido no orifício 8 (a agulha é imersa na solução de substrato 14), apertando rapidamente a ponta 6, a enzima (geralmente cerca de 0,03-0,05 ml) é introduzida no substrato e o dispensador é removido. A mistura dos componentes termina em 2,5-3 s, e a caneta do registrador fixa o início da reação desviando a curva de densidade óptica (ΔA) versus tempo.

Esse dispositivo também possibilita a coleta de amostras do sistema de reação para análise; adicionar inibidores e ativadores ao sistema; alterar as condições de reação (alterar o pH, força iônica, etc.) sem perturbar o registro do curso da reação, o que é muito conveniente, por exemplo, ao estudar a divisão n-NFF fosfatases "ácidas", onde a clivagem n-NFF é realizado em pH 5,0 (ou pH 6-7), e a atividade das enzimas é determinada pelo acúmulo n iões -nitrofenolato a pH 9,5-10,0.

Tal dispositivo também é conveniente para realizar titulação espectrofotométrica de enzimas, etc.

3.2 Dispositivo para medidor de pH

O dispositivo para o medidor de pH consiste em uma ponta modificada do eletrodo de fluxo 1, uma semi-microcélula 2, um dispensador 3 e um circuito eletrônico para conectar o medidor de pH ao registrador. Além disso, o dispositivo inclui um eletrodo medidor de pH padrão (4), uma tampa de suporte de célula (5), uma câmara de fluxo termostática (6), uma solução de substrato (7), um ímã passivo (8) e um ímã ativo ( 9).

A ponta padrão do eletrodo de vazão do medidor de pH (LPU-01) é substituída por um tubo de Teflon 1 (diâmetro interno 1,3-1,5 mm), preenchido com fio de amianto, pré-tratado com solução saturada de KCl. A densidade de enchimento da rosca é controlada de modo que a vazão da solução de KCl através do tubo seja próxima à vazão do eletrodo original não modificado. Essa substituição da ponta permite reduzir o tamanho da célula de trabalho original de 20-25 para 2 ml, o que permite gerenciar com volumes mínimos (1,5 ml) de soluções de preparações bioquímicas caras.

O circuito eletrônico para conectar o medidor de pH (LPU-01) ao registrador consiste em uma fonte de alimentação (bateria DC 12 V), uma resistência de fio variável R 1 (10 - 100 Ohm), que estabelece uma tensão de 9 V no Diodo zener D809 de acordo com a leitura do voltímetro, uma resistência de fio variável R 2 (15-150 Ohm), que regula a configuração do "zero" (ponto de referência) das leituras do medidor de pH na escala do registrador, e fio variável resistência R 3 (35-500 Ohm), que regula a escala de expansão (amplificação) das leituras da escala de pH - medidores no registrador. O circuito opera de forma confiável até que a tensão da fonte caia abaixo de 9 V.

Princípio da Operação. 1,5 ml do substrato é introduzido na célula (um cilindro de vidro 1,7x2,4 cm), e a célula é fixada na tampa de fixação 5. A agitação 9 é ligada e a caneta do registrador escreve um uniforme (básico) linha de referência. Com o auxílio de um dispensador, 0,03 ml da solução enzimática é introduzido no substrato, e a caneta do registrador fixa o início da reação desviando a curva de pH versus tempo (t).

Esse dispositivo não substitui um status de pH, mas, levando em consideração a possibilidade de expandir a escala do medidor de pH, permite registrar com segurança pequenas alterações no pH 0,004-0,005.

3.3 Réguas de nomograma, convenientes para determinar a velocidade inicial

Considerável complexidade de determinar a velocidade inicial no método de tangentes é o cálculo das razões de mudanças nas concentrações de reagentes (Δ[S]) por unidade de tempo (Δt), ou seja, expressão v 0 em M/min das condições que

v 0 = lim Δ[S] / Δt, at, t 0.

Na prática, tal procedimento geralmente consiste em três ou quatro operações separadas: uma tangente é desenhada para a seção inicial da curva de reação, então o número de unidades do valor registrado (densidade óptica, ângulo de rotação, etc.) intervalo de tempo é contado, e isso leva à unidade de tempo e, por fim, recalcular as leituras do registrador para a mudança na concentração do reagente por 1 min (M/min). Os dois tipos de régua de nomograma propostos permitem simplificar este procedimento.

Régua retangular. v 0 é a razão Δ[S]/Δt, isto é. tg ά, onde ά é o ângulo de inclinação da tangente ao eixo do tempo t. A mesma tangente é também a hipotenusa do triângulo retângulo correspondente com catetos [S] e t. Quanto maior v 0 , maior a inclinação da tangente. Portanto, se nos restringirmos a um determinado intervalo de tempo, por exemplo, 1 min, obteremos uma série de triângulos retângulos com diferentes valores da perna [S] (na verdade, diferentes valores de v 0 ). Se, no entanto, ambas as pernas forem graduadas: horizontal - em unidades de referência de tempo (1 min) e vertical - em unidades de mudança nas concentrações de reagentes, por exemplo, em milimoles (mM), e aplique os segmentos resultantes em um formato adequado a partir de um material transparente (plexiglass com cerca de 2 mm de espessura), você pode obter uma régua conveniente para determinar as taxas de reação iniciais. Todos os números e linhas são impressos no verso da régua para eliminar erros de paralaxe ao determinar v 0 .

O procedimento para determinar v 0 é reduzido neste caso a duas operações simples: uma tangente é traçada para a seção inicial da curva cinética t 2 e combinar o ponto zero da perna horizontal t da régua com o início da tangente, a continuação da tangente agora cruzará a escala de concentração [S] no ponto que determina o valor de v 0 em M/min (quando a perna t é horizontal, não são necessárias operações adicionais.

Linha de arco. O procedimento para determinar v 0 pode ser simplificado para uma operação se a escala de concentração for traçada ao longo de um arco de um determinado raio.

Uma linha reta ("básica") 2 é aplicada a uma placa de material transparente (todos os números e linhas também são aplicados no verso da régua) e do ponto zero (t=0, min) desta linha com um raio igual ao comprimento da perna t = 1 min [ , desenhe um arco [S], de cima para baixo ao longo do qual a escala de mudanças nas concentrações do reagente (por exemplo, substrato em mM) é colocada.

Os tipos descritos de réguas, um dispositivo para um espectrofotômetro e um medidor de pH têm sido usados ​​há vários anos para determinar as taxas iniciais de reação (v 0), no estudo da especificidade do substrato de enzimas, para titulação espectrofotométrica, etc.

Conclusão

Neste trabalho, foi considerada uma seção de enzimologia que estuda a dependência da velocidade das reações químicas catalisadas por enzimas em uma série de fatores ambientais. Os fundadores desta ciência são considerados Michaelis e Menten, que publicaram sua teoria do mecanismo geral reações enzimáticas, derivada de uma equação que se tornou o princípio fundamental de todos os estudos cinéticos de enzimas, serve como ponto de partida para qualquer descrição quantitativa da ação das enzimas. A equação original de Michaelis-Menten é uma equação hiperbólica; Lineweaver e Burke contribuíram para a cinética transformando a equação de Michaelis-Menten e obtendo um gráfico de uma linha reta que pode determinar com mais precisão o valor de Vmax.

Com o tempo, a mudança na velocidade da reação enzimática na reação enzimática sob condições experimentais diminui. Uma diminuição na taxa pode ocorrer devido a uma série de fatores: uma diminuição na concentração do substrato, um aumento na concentração de um produto que pode ter um efeito inibitório, mudanças no pH da solução e mudanças no temperatura do meio pode ocorrer. Assim, para cada aumento de 10°C na temperatura, a velocidade da reação dobra ou até menos. A baixa temperatura inativa reversivelmente as enzimas. A dependência da velocidade da reação enzimática com o pH indica o estado dos grupos funcionais do centro ativo da enzima. Cada enzima reage de forma diferente às mudanças no pH. As reações químicas podem ser interrompidas agindo sobre elas com vários tipos de inibição. A velocidade inicial da reação pode ser determinada de forma rápida e precisa usando dispositivos como réguas de nomograma, um dispositivo para um espectrofotômetro e um medidor de pH. Isso permite a representação mais precisa da atividade das enzimas estudadas.

Tudo isso é usado ativamente hoje na prática médica.

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